專利名稱：香蕉枯萎病菌4號小種的lamp檢測引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病害的分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測弓I物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由尖錸孢菌古巴專化型oxysporum f. sp. cwか / ·se)引起的香蕉枯萎病是ー種毀滅性土傳病害，也是我國進(jìn)ロ檢疫對象之一。1904年在美國夏威夷首次報道發(fā)現(xiàn)該病害，1910年在巴拿馬因該病造成重大損失，目前該病害已廣泛分布世界產(chǎn)香蕉國家。我國大陸于I960年在廣西的西貢蕉上首先發(fā)現(xiàn)該病，不久國內(nèi)各重要焦區(qū)都相繼發(fā)生此病害，近年來在福建也發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，并且有繼續(xù)擴(kuò)展蔓延的態(tài)勢。其侵染來源主要是帶菌的吸芽、病株殘體及帶菌土壌。該病菌可通過病株殘體、耕作工具、帶菌土壤以及病區(qū)灌溉水、雨水、蟲等進(jìn)行近距離傳播蔓延，帶病菌的吸芽、土壌及ニ級苗是遠(yuǎn)距離傳播的方式。據(jù)報道香蕉枯萎病菌有4個生理小種，其中以I號小種和4號小種對生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。近年來，隨著農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易及海峽兩岸農(nóng)業(yè)交流的發(fā)展，從香蕉枯萎病疫區(qū)國家或地區(qū)引進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品及種苗的種類和數(shù)量迅速増加，香蕉枯萎病菌也隨著這些植物產(chǎn)品及植物在貿(mào)易中傳入，并對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。目前，防治香蕉枯萎病的方法主要是加強檢測、檢疫，嚴(yán)防帶病種苗進(jìn)入無疫區(qū)，推廣種植無病組培苗，定期檢查蕉園，發(fā)現(xiàn)零星病株應(yīng)及時清除銷毀，并撒施石灰或尿素處理土壌；種植抗病和耐病的香蕉品種；重病區(qū)則應(yīng)輪作其它作物如水稻、花生、甘蔗等經(jīng)濟(jì)作物。該病害的檢疫檢測技術(shù)是以往研究中的薄弱環(huán)節(jié)，因此，國內(nèi)外目前仍無十分有效的辦法控制香蕉枯萎病擴(kuò)散蔓延為害，同吋，無病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)對于無疫區(qū)農(nóng)作物，尤其是果樹等多年生作物香蕉枯萎病的防治至關(guān)重要，因此為了及時堵截國外病原菌的傳入，防止香蕉枯萎病從疫區(qū)傳入非疫區(qū)，建立一套穩(wěn)定、可靠、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對香蕉苗及種植地區(qū)土壤進(jìn)行檢測和監(jiān)測是十分必要的。傳統(tǒng)的植物病原的檢疫檢測技術(shù)由于簡便、易行，目前仍被采用，但由于靈敏度低和耗時長，已經(jīng)不能滿足新形勢下植物病害診斷和病害控制工作的需要，迫切需要新型檢測技術(shù)與之配套。近年來各國均致カ于分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究，取得了很大的進(jìn)展，其中以多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的病原檢測方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物病原的檢測和鑒定。植物病原生物的PCR分子檢測技術(shù)是當(dāng)前該領(lǐng)域的發(fā)展方向，許多重要病原生物都已經(jīng)建立了分子檢測技術(shù)，越來越多的分子檢測試劑盒已經(jīng)或正在被研制。由于客觀 原因，我國雖然在植物病原生物分子檢測技術(shù)方面起步較晚，但目前也研制出了許多用于植物病原生物檢測的技術(shù)，尤其是ー些擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測方法，并將之投入到商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用中。目前已有ー些利用分子手段鑒定香蕉枯萎病菌，即尖錸孢菌古巴專化型(.Fusarium oxysporum f. sp. cwか / ·se)的方法，John A.等報道了香蕉枯萎病菌基于多重PCR的分子檢測；廖林鳳等報道了用隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)技術(shù)，從90個RATO隨機引物中篩選出引物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，并設(shè)計特定引物作為香蕉枯萎病菌4號小種的特異性SCAR標(biāo)記；劉景梅等用RAPD技術(shù)，從200條隨機引物中篩選出8條引物可產(chǎn)生生理小種RAPD標(biāo)記12個，根據(jù)這些特異片段序列分別設(shè)計相應(yīng)的SCAR引物，通過對18個菌株的PCR擴(kuò)增檢驗，有4個RAPD標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，其中Race I-SCAR標(biāo)記I個、Race 4-SCAR標(biāo)記2個、同時能鑒定出2個小種的SCAR標(biāo)記I個；呂偉成等對香蕉枯萎病菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，構(gòu)建了香蕉枯萎病菌生理小種ITS-SCAR雙重PCR檢測體系，該方法可以同時檢測香蕉枯萎病菌I號和4號生理小種；葉建軍等構(gòu)建了以ITS測序與SCAR分子標(biāo)記相結(jié)合的香蕉病原菌F0C4分子檢測方法；王國芬、葉明珍、漆艷香、陳靜華等根據(jù)ITS序列、16SrDNA序列、β-微管蛋白基因(β-tubulin)保守序列等設(shè)計特異引物檢測香蕉枯萎病菌。目前PCR特異性檢測技術(shù)仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以進(jìn)行，限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。循環(huán)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification,簡稱 LAMP)是2000年由日本榮研株式會社Notomi等人開發(fā)的ー種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技木。LAMP反應(yīng)針對靶基因的6個位點設(shè)計出4條引物，利用ー種鏈?zhǔn)街脫Q活性的DNA聚合酶(fci DNApolymerase),在恒溫條件下(60 - 65°C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于LAMP反應(yīng)的高效性和等溫快速擴(kuò)增的特點，在90分鐘內(nèi)可將擴(kuò)增IO9 - 101°倍。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應(yīng)簡単、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報道極少，香蕉枯萎病菌的檢測國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物。本發(fā)明還提供了ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法。本發(fā)明另外提供了ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測試劑盒。ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物如下
外側(cè)引物 F3:5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’ ；
內(nèi)側(cè)引物 FIP :5’ -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3’，
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’ ；
環(huán)引物 F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3，，
B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3’。ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，包括引物設(shè)計、LAMP擴(kuò)增和擴(kuò)增結(jié)果觀察，所述LAMP檢測方法的反應(yīng)體系包括引物混合液、反應(yīng)混合液、I. OU Bst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25 uL ;所述引物混合液由權(quán)利要求I所述的外側(cè)引物F3、B3，內(nèi)側(cè)引物FIP、BIP和環(huán)引物B-loop、F-loop組成，其中外側(cè)引物F3和B3各5pmol,內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各40 pmol,環(huán)引物B-loop、F-Ioop各20 μ mo I ;所述反應(yīng)混合、液配制如下40mM Tris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% Triton X-100，I. 6M 甜菜堿和 2. 8 mM dNTPs。所述LAMP檢測方法的反應(yīng)條件為在60-65°C溫育60 min, 80_85°C保溫lOmin。所述反應(yīng)條件優(yōu)選為在63°C溫育60 min,80°C保溫lOmin。所述擴(kuò)增結(jié)果觀察為熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法；所述熒光染料目測觀察法在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入IuL顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；所述瓊脂糖凝膠電泳法取2ULLAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。ー種香蕉枯萎病菌4號小種特異性的檢測試劑盒，包括
1)引物混合液外側(cè)引物F3和B3各5pmol,內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各40pmol，環(huán)引物 B-Ioop 和 F-Ioop 各 20 μ mo I ；
2)反應(yīng)混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；
3)I. OU Bst DNA 聚合酶。所述LAMP檢測試劑盒還包括顯色劑，所述的顯色劑為SYBR green I。所述LAMP檢測試劑盒還包括從罹病香蕉枯萎病植物組織或土壤中提取DNA的提取試劑，由2% CTAB ,10% SDS、體積比為25:24:1的酚/氯仿/異戊醇混合液、氯仿、3M NaAC,
O.4%脫脂奶粉溶液、7. 5 M NH4ACU0mg/ml蛋白酶K、無水こ醇、70%こ醇、IXTE組成。所述DNA模板為從罹病香蕉枯萎病的植物組織或土壤中提取。當(dāng)在用于植株組織中存在香蕉枯萎病菌時，所述的提取方法為CTAB法提取植物組織中香蕉枯萎病菌DNA (具體步驟見實施例2)。當(dāng)在土壤樣品中存在香蕉枯萎病菌條件下，采用土壤DNA提取法提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA (具體步驟見實施例3)。上述香蕉枯萎病菌4號小種LAMP分子檢測方法或試劑盒在診斷植物組織、土壌的香蕉枯萎病菌感染情況或鑒別香蕉枯萎病菌中的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題主要采取的技術(shù)方案包括以下三個部份1、提供了 4條用于檢測香蕉枯萎病菌的LAMP引物序列，分別命名為F3、B3、FIP、BIP ;配制并優(yōu)化了 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，有利于LAMP以最高效率對樣品進(jìn)行擴(kuò)增；2、提供了多種LAMP結(jié)果檢測方法，主要有熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳。具體包括以下步聚
I、罹病植物組織或土壤中香蕉枯萎病菌DNA提取
采用CTAB法提取植物組織中香蕉枯萎病菌DNA ;采用土壌DNA提取法提取土壌中香蕉枯萎病菌的DNA。2、LAMP 引物設(shè)計
I)采用CTAB法提取供試香蕉枯萎病菌株基因組DNA ;2)應(yīng)用隨機引物進(jìn)行RAPD分析篩選，篩選得到一條RAPD隨機引物，序列為5’-TGCCGAGCTG-3’，使用篩選出的隨機引物再次對供試菌株基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，得到I條香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段；3)使用切膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段，連接到載體上，通過適宜溫度熱擊后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，待細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因后，在加有含有氨節(jié)青霉素Amp、異丙基硫代-β -D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-Π引哚-D-半乳糖苷的LB平板上篩選陽性白斑；4)挑取轉(zhuǎn)化子白斑的陽性克隆，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用內(nèi)切酶及^ I和雙酶切檢測證實所克隆片段確實為香蕉枯萎病菌特異性的DNA片段；5)迸行DNA的測序，得到香蕉枯萎病菌特異基因序列；6)從這ー特異基因序列中設(shè)計6條LAMP引物；
F3 :5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’，
FIP :5， -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3'
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’
F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3’
B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3，
3、LAMP反應(yīng)體系的配制。4、LAMP 反應(yīng)擴(kuò)增條件在 60_65°C溫育 60 min, 80_85°C保溫 IOmin 滅活ガDNA聚合酶。5、LAMP結(jié)果檢測結(jié)果可以采用以下ニ種方法檢測①將上述反應(yīng)完的體系中加入IuL的顯色劑，輕晃混勻，即可觀察，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。②取2uL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。本發(fā)明所提供的香蕉枯萎病菌4號小種LAMP快速檢測技術(shù)具有其它檢測方法所無法比擬的優(yōu)點
1、結(jié)果可靠本發(fā)明所設(shè)計出的ー種LAMP特異性檢測引物，僅針對香蕉枯萎病菌生理4號小種進(jìn)行檢測，已經(jīng)對源于中國發(fā)生香蕉枯萎病的福建、海南、廣東等地的香蕉枯萎病菌和帶香蕉枯萎病菌的土樣、植物組織進(jìn)行了測試驗證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保 證；
2、特異性強所采用的引物是針對香蕉枯萎病菌特異RAH)基因序列中6個不同區(qū)域設(shè)計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故特異性聞。3、靈敏度高:對香蕉枯萎病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg，比常規(guī)PCR檢測高100倍以上。4、快速高效核酸擴(kuò)增在I. 5h內(nèi)即可完成，比常規(guī)PCR要節(jié)省2 - 3h，且產(chǎn)物可以擴(kuò)增至Ij IO9 - 101°倍。5、操作簡單LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，只需ー個水浴鍋即可，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見。


圖I為本發(fā)明所要檢測的香蕉枯萎病菌4號小種LAMP特異性檢測圖；其中A為擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果；B為染料檢測結(jié)果；圖中M為DL 2000 DNA ladder marker，I泳道為陰性對照，2泳道為尖孢錸刀菌古巴專化型(Race4)，3泳道為尖孢錸刀菌古巴專化型(Racel)，4泳道為尖孢錸刀菌棉花專化型，5泳道為尖孢錸刀菌黃瓜專化型，6泳道為尖孢錸刀菌番茄專化型，7泳道為尖孢錸刀菌西瓜專化型，8泳道為尖孢錸刀菌番薯專化型，9泳道為尖孢錸刀菌西瓜專化型，10泳道為擬輪生錸刀菌，11泳道為茄腐錸刀菌，12泳道為擬輪生錸刀菌，13泳道為木賊錸刀菌，14泳道為禾谷錸刀菌，15泳道為斐濟(jì)球腔菌，16泳道為芭蕉球腔菌，17泳道為芭蕉炭疽菌，18泳道為蠶豆葉殼ニ胞菌，19泳道為立枯絲核菌，20泳道為致病疫霉菌。圖2為本發(fā)明香蕉枯萎病菌4號小種LAMP靈敏性檢測 圖中M 為 DL 2000 DNA ladder marker, I 泳道為 100 ng，2 泳道為 10 ng，3 泳道為 Ing，4泳道為100 pg，5泳道為10 pg，6泳道為I pg，7泳道為100 fg，8泳道為10 fg，9泳道為I fg，10泳道為O. I fg。圖3為本發(fā)明香蕉發(fā)病組織和帶菌土壌LAMP檢測結(jié)果圖；
圖中泳道I、2、3為發(fā)病的香蕉組織，泳道6為發(fā)病土壌，泳道4、5、7為健康香蕉組織，泳道8為陰性對照，9泳道為陽性對照，M為DL 2000 DNA ladder marker。
具體實施例方式實施例I
以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩描述。香蕉枯萎病菌4號小種LAMP特異檢測引物
F3 :5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’，
FIP :5， -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3'
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’。香蕉枯萎病菌4號小種特異性LAMP檢測試劑盒，包括
O引物混合液外側(cè)引物F3和B3各5pmol,內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各40 pmol ；
2)反應(yīng)混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；
3)I. OU Bst DNA 聚合酶。試劑盒還包括顯色劑,所述的顯色劑為SYBR green I。試劑盒還包括從罹病香蕉枯萎病植物組織或土壤中DNA提取試劑，由2% CTAB,10% SDS、酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)、氯仿、3M NaAC,O. 4%脫脂奶粉溶液、7. 5 MNH4AC、10mg/ml蛋白酶K、無水こ醇、70%こ醇、I XTE組成。LAMP反應(yīng)體系包括弓I物混合液、反應(yīng)混合液、I. OU Bst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25 uL，所述引物混合液為外側(cè)引物F3和B3各5pmol，內(nèi)側(cè)引物FIP 和 BIP 各 40 pmol ;所述的反應(yīng)混合液為 40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4, 20mM KCL, 16mM MgSO4,0. 2% Triton X-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs。所述的LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育60 min, 82°C保溫lOmin。所述的顯色劑為SYBR green I。檢測的特異性在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入IuL顯色劑，除了以來自我國枯萎病發(fā)生地海南、廣東和福建等省份的香蕉枯萎病菌株為模板的結(jié)果中可觀察到強烈的綠色突光外，以oxysporum的非古巴專化型、其它錸刀菌/^sari spp及其它的真菌和細(xì)菌等菌株為模板的結(jié)果中則沒有觀察到，仍為橙色。取上述反應(yīng)液2uL在2%瓊脂糖凝膠電泳，以香蕉枯萎病菌株為模板的結(jié)果均出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，而以其它的真菌和細(xì)菌菌株為模板的結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)有擴(kuò)增產(chǎn)物(表1，圖I)。檢測的靈敏性用不同濃度的香蕉枯萎病菌DNA進(jìn)行靈敏性檢測，以IOfg的純DNA為模板仍可觀察到綠色熒光，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果也出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帯，說明LAMP最低的檢測率在DNA水平上可達(dá)到IOfg (圖2)。表I驗證引物對香蕉枯萎病菌特異性所用菌株、寄主、來源及LAMP檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物，其特征在于所述引物如下外側(cè)引物 F3:5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’ ；內(nèi)側(cè)引物 FIP :5’ -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3’，BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’ ；環(huán)引物 F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3，，B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3’。
2.ー種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，包括引物設(shè)計、LAMP擴(kuò)增和擴(kuò)增結(jié)果觀察，其特征在于所述LAMP檢測方法的反應(yīng)體系包括引物混合液、反應(yīng)混合液、I. OUBst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25 uL ;所述引物混合液由權(quán)利要求I所述的外側(cè)引物F3、B3，內(nèi)側(cè)引物FIP、BIP和環(huán)引物B-Ioop、F-Ioop組成，其中外側(cè)引物F3 和 B3 各 5pmol,內(nèi)側(cè)引物 FIP 和 BIP 各 40 pmol,環(huán)引物 B-loop、F-Ioop 各 20 μ mo I ;所述反應(yīng)混合液配制如下40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M 甜菜堿和 2. 8 mM dNTPs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，其特征在于所述LAMP檢測方法的反應(yīng)條件為在60-65°C溫育60 min，80_85°C保溫lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，其特征在于所述擴(kuò)增結(jié)果觀察為熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法；所述熒光染料目測觀察法在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入IuL顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；所述瓊脂糖凝膠電泳法取2ULLAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。
5.ー種香蕉枯萎病菌4號小種特異性的檢測試劑盒，其特征在于所述LAMP檢測試劑盒包括 1)引物混合液外側(cè)引物F3和B3各5pmoI，內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各40pmoI，環(huán)引物B-Ioop 和 F-Ioop 各 20 μ mo I ；2)反應(yīng)混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；3)I. OU Bst DNA 聚合酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述LAMP檢測試劑盒還包括顯色劑，所述的顯色劑為SYBR green I。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述LAMP檢測試劑盒還包括從罹病香蕉枯萎病植物組織或土壤中提取DNA的提取試劑，由2%CTAB,10% SDS、體積比為25:24:1的酚/氯仿/異戊醇混合液、氯仿、3M NaAC,O. 4%脫脂奶粉溶液、7. 5 M NH4AC、10mg/ml蛋白酶K、無水こ醇、70%こ醇、IXTE組成。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物及其應(yīng)用。其反應(yīng)體系中香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物為F3、B3、FIP、BIP，F(xiàn)-loop，B-Loop通過對罹病植物組織中香蕉枯萎病菌DNA提取，LAMP等溫擴(kuò)增檢測，從而快速和特異性檢測香蕉枯萎病菌。本發(fā)明的檢測方法結(jié)果可靠、特異性強、靈敏度高、快速高效、操作簡便，在香蕉枯萎病菌現(xiàn)場快速檢測和香蕉枯萎病的早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102690887SQ20121019613
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者蘭成忠, 李本金, 翁啟勇, 陳慶河 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所