專利名稱：復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ace抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及功能食品加工技術(shù)，特別是復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE (即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑 制肽的方法。
背景技術(shù)：
全世界每年因高血壓死亡約1200萬(wàn)人，在發(fā)達(dá)國(guó)家及較發(fā)達(dá)國(guó)家，其患病率高達(dá)20%以上，在發(fā)展中國(guó)家，近年來(lái)高血壓的患病率也在不斷增長(zhǎng)。目前，我國(guó)高血壓患病率已上升到11. 88%，患病人數(shù)估計(jì)I億多人。在高血壓人群中有95%以上的患者是原發(fā)性高血壓，通過抑制ACE活性可有效地降低原發(fā)性高血壓。臨床上常用的ACE抑制劑有卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴諾普利(Lisinopril)、福辛普利(Fosinopril)等，但是這些合成的ACE抑制劑具有不良反應(yīng)，如引發(fā)蛋白尿和白細(xì)胞減少等，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。食物源ACE抑制肽通常是在溫和條件下由蛋白酶水解蛋白質(zhì)而獲得，其食用安全性高，無(wú)毒副作用，對(duì)高血壓患者具有降壓效果，而對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用，不存在降壓過度的現(xiàn)象。除降血壓功能外，食物源ACE抑制肽同時(shí)具有減肥、免疫調(diào)節(jié)和易消化吸收等功能，有著人工合成的藥用ACE抑制劑不可比擬的優(yōu)越性，其良好的安全性能以及多方面的生理功能吸引了眾多的研究者，開發(fā)天然ACE抑制肽產(chǎn)品已成為高血壓等非藥物治療中的重要組成部分。目前已從乳蛋白、卵蛋白、油料蛋白、谷物蛋白、肉蛋白、魚蛋白等分離出多種ACE抑制肽，并通過反相高效液相色譜法(RPlPLC)、紫外分光光度法等分析了有ACE抑制活性的組分。這些方法多采用單一蛋白酶水解蛋白質(zhì)、超濾分離、活性炭脫色精制等，肽得率和ACE抑制活性較低，灰分含量較高等而影響其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，該方法制備的ACE抑制肽可提高ACE抑制活性和肽得率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法包括如下步驟I)調(diào)節(jié)質(zhì)量體積比濃度為5 8%的大米分離蛋白水溶液的溫度至45飛5°C，pH值至8. 5 9. 5，按加酶量48 60AU/kg加入堿性蛋白酶水解12(Tl50min ;然后，2)調(diào)節(jié)體系溫度至36 38°C，pH值至7 8，按加酶量12. 5 25USP/kg加入胰蛋白酶水解3(T60min ;再然后，3)調(diào)節(jié)pH值至5. (Γ5. 5，酶解液依次經(jīng)固液分離、超濾膜篩分、脫鹽、濃縮和冷凍干燥后，制得ACE抑制肽產(chǎn)品。進(jìn)一步地，所述步驟3)中，超濾膜是截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000的超濾膜。進(jìn)一步地，所述步驟3)中，脫鹽步驟采用大孔樹脂吸附方法或采用離子交換樹脂吸附方法。進(jìn)ー步地，所述步驟I)中，大米分離蛋白水溶液質(zhì)量體積比濃度為7. 5%，pH值為9. 0，水解溫度為50°C，酶與底物比為54 AU/kg，水解時(shí)間為120min。進(jìn)ー步地，所述步驟2)中，pH值為8，水解溫度為37°C，酶與底物比為20USP/kg，水解時(shí)間為30min。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)I.エ藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件 溫和，利于エ業(yè)化生產(chǎn)。大米蛋白主要為谷蛋白，在堿性溶液中溶解度較高。堿性蛋白酶最適pH值為8 10，先采用堿性蛋白酶水解能使大米分離蛋白在水中具有較高的溶解度，酶分子和蛋白質(zhì)分子可以充分接觸，縮短水解時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。后續(xù)膜分離、樹脂洗脫均在常溫下操作，能耗小，產(chǎn)品中灰分低，利于エ業(yè)化生產(chǎn)。2. ACE抑制肽得率高、活性強(qiáng)。堿性蛋白酶主要水解羧基末端為疏水性氨基酸的肽鍵，胰蛋白酶主要水解羧基末端為堿性氨基酸的肽鍵。采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶分步水解大米分離蛋白，不僅反應(yīng)條件溫和，而且由于ニ種蛋白酶作用不同酶切位點(diǎn)，ACE抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量低，主要集中在1000以下，因此ACE抑制肽的得率大于40%，其IC5tl值(ACE抑制活性為最大值ー半時(shí)的ACE抑制肽的濃度)為0. 15-0. 20mg/ml。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明。實(shí)施例I米用丹麥Novozymes公司提供的堿性蛋白酶(Alcalase 2. 4L FG, 2.4AU/g,枯草桿菌生產(chǎn)，其活力采用動(dòng)力學(xué)ニ甲醛酪蛋白法測(cè)定。)及胰蛋白酶(Trypsin Novo 6.0,1250USP/mg,由豬胰腺中提取，其活力采用紫外分光光度法測(cè)定。)制備エ藝條件為大米分離蛋白水溶液質(zhì)量體積比濃度為7. 5%，pH值為9，反應(yīng)溫度為50°C，加酶量為54AU/kg，水解反應(yīng)120min后，迅速調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為37°C，pH值為8，按加酶量20USP/kg加入胰蛋白酶水解反應(yīng)30 mirio然后調(diào)節(jié)pH值至5. 0,滅酶并去除大分子多肽。酶解液在4000 r/min條件下離心分離20 min，取上清液通過截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000的超濾膜分離，收集透過液經(jīng)聚苯こ烯型大孔吸附樹脂脫鹽，用75%的こ醇洗脫。こ醇洗脫液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥，制得ACE抑制肽產(chǎn)品，外官呈白色粉末狀，得率為46%。測(cè)定其抑制ACE的抑制率和濃度，計(jì)算IC5tl值，以及灰分等其他指標(biāo)見表I。表I大米ACE抑制肽主要理化指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于包括如下步驟 O調(diào)節(jié)質(zhì)量體積比濃度為5 8%的大米分離蛋白水溶液的溫度至45飛5°C，pH值至8.5 9. 5，按加酶量48 60AU/kg加入堿性蛋白酶水解12(Tl50min ;然后， 2)調(diào)節(jié)體系溫度至36 38°C，pH值至7 8，按加酶量12.5 25USP/kg加入胰蛋白酶水解30 60min ;再然后， 3)調(diào)節(jié)pH值至5.(Γ5. 5，酶解液依次經(jīng)固液分離、超濾膜篩分、脫鹽、濃縮和冷凍干燥后，制得ACE抑制肽產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求I所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟3)中，超濾膜是截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000的超濾膜。
3.如權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟3)中，脫鹽步驟采用大孔樹脂吸附方法。
4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟3)中，脫鹽步驟采用大孔樹脂吸附方法。
5.如權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟3)中，脫鹽步驟采用離子交換樹脂吸附方法。
6.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟3)中，脫鹽步驟采用離子交換樹脂吸附方法。
7.如權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟I)中，大米分離蛋白水溶液質(zhì)量體積比濃度為7. 5%，pH值為9. 0，水解溫度為50°C，加酶量為54AU/kg，水解時(shí)間為120min。
8.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟I)中，大米分離蛋白水溶液質(zhì)量體積比濃度為7. 5%，pH值為9. 0，水解溫度為50°C，加酶量為54AU/kg，水解時(shí)間為120min。
9.如權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟2)中，pH值為8，水解溫度為37°C，加酶量為20USP/kg，水解時(shí)間為30min。
10.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于所述步驟2)中，pH值為8，水解溫度為37°C，加酶量為20USP/kg，水解時(shí)間為30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合酶水解大米分離蛋白制備ACE抑制肽的方法，該方法包括如下步驟1)調(diào)節(jié)質(zhì)量體積比濃度為5~8%的大米分離蛋白水溶液的溫度至45~55℃，pH值至 8.5~9.5，按加酶量48~60AU/kg加入堿性蛋白酶水解120~150min；然后，2)調(diào)節(jié)體系溫度至36~38℃，pH值至7~8，按加酶量12.5~25USP/kg加入胰蛋白酶水解30~60min；再然后，3)調(diào)節(jié)pH值至5.0~5.5，酶解液依次經(jīng)固液分離、超濾膜篩分、脫鹽、濃縮和冷凍干燥后，制得ACE抑制肽產(chǎn)品。本發(fā)明采用兩種酶復(fù)合分別作用不同酶切位點(diǎn)，制備的ACE抑制肽得率高、活性強(qiáng)，并且該方法工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102864200SQ201210346489
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者陳季旺, 蔡廣霞, 吳永寧 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院