專利名稱：比伐盧定的液相合成方法
技術領域：
本發明涉及一種20肽，具體說涉及比伐盧定的合成，尤其是比 伐盧定的液相合成方法，屬于多肽合成技術領域。
背景技術：
比伐盧定(bivalirudin)是2000年12月美國食品藥物管理局FDA 批準上市的直接凝血酶抑制劑之一 (商品名Angiomax，由Medicines 制藥公司出品)，它來源于水蛭素衍生物，是一種合成的含20個氨基 酸的多肽，是凝血酶直接的、特異的、可逆性抑制劑。其相對分子質 量為2180，氨基酸序列為D畫Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ash -Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro隱Glu-G 1 u-Tvr-Leu 。
比伐盧定氨基端的D-Phe-Pro-Arg-Pro區域是與凝血酶活性點相 互作用的位點，它可與游離型或與結合型凝血酶催化位點和底物識別 位點發生特異性結合，從而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解 本品多肽順序中Arg3和Pro4之間的肽鍵，使本品失活，所以比伐盧 定對凝血酶的抑制作用是可逆而短暫的。比伐盧定與水蛭素相反，經 腎排泄不是其主要的清除途徑，它可能是被內源性多肽酶降解，可安 全用于腎損害患者，腎功能正常時，比伐盧定的半衰期為25min。基 于比伐盧定的以上特點與生物學活性，用比伐盧定作為防治血栓的藥 物有諸多優點(O專一性強，特異性直接抑制凝血酶活性，且對血 栓結合的凝血酶也有抑制作用；(2)半衰期短，且對凝血酶的抑制作 用是可逆性的，故而抗凝效果可以被預測，不需要實驗室監測；(3) 可安全用于腎損害患者。
4比伐盧定在藥理學上克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺點，
用于抗凝防栓安全有效。諸多臨床試驗研究表明，它可替代肝素安全、
有效地用于冠狀動脈血管成形術(PCI)、不穩定型心絞痛以及急性心
肌梗死溶栓輔助治療，尤其在肝素誘導的血小板減少癥Hf的抗栓治
療中有獨特的優勢，且在外周動脈介入治療PPI、心肺移植手術及腎
功能不全患者防栓抗栓治療中亦顯示出良好的作用。因此，比伐盧定 是一種有著很好臨床應用前景的藥物，目前已經被歐美和其它地區，
如加拿大、以色列、新西蘭、阿根廷等國家批準，允許其上市。2005 年全球銷售1.5億美元，2006年全球銷售2.1億美元，2007年全球銷 售2.55億美元，其市場應用正在不斷擴大。然而，比伐盧定在我國 尚未上市，Medicines公司也沒有在亞洲地區的上市計劃，這在很大 程度上延誤了我國心血管醫療事業——尤其是冠狀動脈血管成形術 的發展。實現比伐盧定的規模化和產業化生產，能夠很好地促進比伐 盧定藥物在我國醫療事業的應用，提高心臟手術的醫療水平。
比伐盧定作為一個很有合成難度的多肽藥物，其高昂的合成成本 限制了大規模生產和市場應用。目前，國內外尚無使用液相合成法制 備比伐盧定的文獻和專利報道。己有的主要研究論文及專利如下
美國專利US5196404是比伐盧定的化合物專利，最早報導了比 伐盧定的制備方法(1990年7月6日申請)，以BOC保護的氨基酸 為原料，采用固相合成，最后用強刺激、劇毒的HF，在特殊的聚四 氟乙烯裝置中切肽樹脂。此方法不適合規模化合成。隆薩股份公司于 2006年3月4日申請的WO2006045503專利，與EP1737889、 CN 200580043573.1是同族專利，采用對酸不穩定的樹脂，得到脫保護肽 或部分保護肽，后者經純化再脫保護得到目的肽。此法可以減少9位天冬酰胺變為天冬氨酸的副反應，能夠得到純度大于99%的目的肽。
上海子能2006年3月10日申請的CN200610024611.5專利，名稱為 "固相多肽合成比伐盧定的制備方法"，系用Wang樹脂或CTC樹脂 合成；Novetide公司2007年3月22日申請的WO2007033383專利， 與EP1805204、 US2007093423是同族專利，名稱為Process for production of Bivalirudin，也是采用CTC樹脂進行合成。
上述文獻報道的比伐盧定的固相合成方法，需采用昂貴的特殊樹 脂和大過量的特殊保護氨基酸及縮合試劑，難以實現大規模合成，生 產成本高。有的工藝需要用到劇毒的氟化氫，需要特殊的反應裝置， 也很難實現大規模生產。

發明內容
本發明的目的是解決現有技術存在的上述問題，提供一種生產成 本相對較低、適宜規模化生產的比伐盧定的液相合成方法。
本發明的技術解決方案是
首先，用液相法逐步合成三個全保護片段，艮P:
"片段A", N-端全保護的6肽W-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3，
"片段B"，中段全保護的6肽Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3，
"片段C"， C-端全保護的8肽I^-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro -Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;
然后，將"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端全保護的14肽W-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4)隱Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;接著，將"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐盧定的全保護
20肽R、D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4) -Phe-Glu ( R4 ) -Glu ( R4 )誦Ile-Pro隱Glu (R4 ) -Glu (R4) -Tyr ( R5) -Leu-OR3;
最后，脫除上述全保護20肽的所有保護基團Ri R5，得到比伐 盧定的粗品，進一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe陽Glu-Glu-Ile-Pro國Glu陽Glu畫Tyr畫Leu。
本發明采用液相合成法制備比伐盧定，所需設備簡單，與固相合
成法相比，具有許多優點(1)不需要樹脂和大過量的保護氨基酸及 縮合劑；(2)易于實現規模化生產，大大降低生產成本；(3)不需大 量的洗滌溶劑，常用溶劑可回收再利用；(4)不必使用劇毒的氟化氫 和有一定神經毒性的六氫吡啶，易于實現安全生產，沒有傳統固相多 肽工藝面臨的巨大環保壓力。
具體實施例方式
本發明以液相合成比伐盧定為目的，綜合固相法與液相法合成多 肽的先進方法和技術，通過對比伐盧定所含氨基酸的正交保護策略、 縮合劑和溶劑的選擇、反應條件的優化、粗產品的純化等多種因素進 行全面分析，設計出一條新穎的比伐盧定的液相合成路線，能夠在保 證產品質量的前提下，最大限度地降低比伐盧定的合成成本。
本發明的主要技術路線是——
首先合成三個較大的全保護片段"片段A" N-端全保護的6肽， R^-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3;"片段B"中段全保護的6 肽，Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3;"片段C"C-端全保護 的8肽，RLG1u (R4) -Glu (R4)畫Ile-Pro-Glu (R4)陽Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3。然后將"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端
全保護的14肽:R!-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu畫OR3。
再將"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐盧定的全保護20 肽RLD-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly匪Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4)誦Glu ( R4 ) -Ile-Pro-Glu ( R4 ) -Glu (R4 ) -Tyr ( R5) -Leu-OR3 。
最后，脫除上述全保護20肽的所有保護基團Ri R5，得到比伐 盧定的粗品，進一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly畫Asn-Gly畫Asp-Phe畫Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr畫Leu。
根據本發明技術方案，脫除所述全保護20肽的所有保護基團的 方法是用堿脫除C-末端保護，用酸脫除N-末端及所有側鏈保護基。 優選地，可用TFA-TIS溶液一次性脫除所述全保護20肽的兩端及側 鏈的所有保護基團。脫除所有保護基團之后獲得的比伐盧定粗品，可 以采用高效液相色譜(HPLC)進行純化。
本申請發明人發現，上述液相法合成比伐盧定的方法中，保護基 團R1 115分別優選以下種類——
R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (芐氧羰基)，Fmoc (9-芴甲氧羰基)；
R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)，Pmc (2,2,5，7,8-五甲 基苯并二氫吡喃-6-磺酰基)，Pbf (2，2,4,6,7-五甲基苯并二氫呋喃-5-磺酰基)，N02 (硝基)，Z (芐氧羰基)，Z2 (雙芐氧羰基)；
R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分別為乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (芐基)；
R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)；
R5=Bzl (節基)，tBu (叔丁基)。下面以具體實例進一步說明本發明液相法制備比伐盧定的過程， 其僅為典型范例，但并不意味著對本發明保護范圍的限制。
1、"片段A" N-端全保護6肽的合成。工藝過程如下
Boc-Gly-OHH-Gly-OMe.HC l
I_1
j DCC-HOBt-NMM
Boc-Gly匿Gly-OMe
J 4N HC1 in Dioxine Boc-Pro-OH H-Gly-Gly-OMe.HCl
j DCC-HOBt匿NMM Boc-Pro-Gly-Gly扁OMe
j 4N HC1 in Dioxine Z-Arg(Pbf)-OH H-Pro-Gly-Gly-OMe
I__I
J PyBOP-NMM Z-Arg(Pbf)-Pro-GIy-Gly-OMe j H2-Pd/C Z-Pro-OH H匿Arg(Pbf)-Pro畫Gly-Gly-OMe
+ PyBOP-NMM Z-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe j H2-Pd/C
Boc-D-Phe-OH H-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe
j PyBOP-畫M Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro匿Gly-Gly-OMe j 2N NaOH/H + Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH
1.1 H-Gly-Gly-OMe HC1的制備
將Boc-Gly-OH (30克，181.5mmol)溶于200ml THF中，室溫 下依次加入H-Gly-OMe'HCl (22.6克，181.5mmol)， DCC(37.4克， 200mmol)禾n HOBt (24.5克，200mmol)，攪拌下滴加NMM (18.3 克，181.5mmol)，滴加完畢，室溫攪拌30分鐘。TLC跟蹤反應，反 應完畢后，濾除固體，減壓蒸去THF，加入150ml乙酸乙酯溶解殘 余物，分別用10%的檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶 液洗滌乙酸乙酯溶液，分離有機相，經無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑， 減壓蒸去乙酸乙酯，加入200ml石油醚，冰浴冷卻，析出固體。濾集固體，干燥后得32克Boc-Gly-Gly-OMe，收率76%,產物Rf = 0.5 (甲醇乙酸乙酉旨=1:20)。將32克Boc-Gly-Gly-OMe與150ml、 4N 的HCl/二氧六環在室溫下反應1小時，反應析出固體，濾集固體， 干燥后得17.5克H-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+lT): 147.00 (分 子量146.14)。
1.2 H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1的制備
冰浴下，將Boc-Pro-OH (17.5克，70mmo1)和12.7克(70mmo1) H-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入DCC (15.86克， 70mmol)， HOBT (10.4克，77mmo1)， NMM (7.86g， 77mmo1)，緩 慢升溫至室溫反應l小時(TLC跟蹤反應)。反應完畢后，過濾，收 集濾液，減壓除去溶劑，殘余物用100ml乙酸乙酯溶解，分別用10% 擰檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌， 無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后，殘余物經硅膠柱層析純化得22.3 克Boc-Pro匿Gly畫Gly隱OMe，收率93%。將22.3克Boc-Pro-Gly隱Gly陽OMe 與100ml、 4N的HCl/二氧六環在室溫下反應1小時，反應析出固體， 濾集固體并干燥，得18.0克H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+H^: 244.13 (分子量:243.27)。
1.3 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe的制備
冰浴下，將Z-Arg (Pbf) -OH (16克，28.5mmo1)和6.93克 (28.5mmo1) H畫Pro-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入 PyBOP (14.1克，27mmol)， NMM (2.3克，28.5mmo1)，緩慢升溫 至室溫反應1.5小時(TLC跟蹤反應)。反應完畢后，減壓除去溶劑， 剩余物經硅膠柱層析純化得20克Z-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe， 收率90% 。室溫下，將Z-Arg( Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe( 20克，25.4mmo1)和10。/。Pd/C (2克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護下反應2小時， 減壓除去溶劑后，得固體16.5克，收率99%， ESI-MS(M+lT): 652.30 (分子量651.47)。
1.4 H-Pro-Arg (Pbf)隱Pro-Gly-Gly隱OMe的制備
冰浴下，將Z-Pro-OH(11.9克，47.6mmol)和31.0克(47.6mmo1) H-Arg (pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe溶于100ml THF中，加入PyBOP (23.5 克，45.2mmol)， NMM (4.8克，47.6mmo1)。緩慢升溫至室溫反應3 小時(TLC跟蹤反應過程)。反應完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經 硅膠柱層析純化得40克Z-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe，收率 96%。室溫下，將Z畫Pro畫Arg (Pbf)畫Pro畫Gly-Gly畫OMe (16克，18mmo1) 和10%Pd/C (1.6克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護下反應2小時， 減壓除去溶劑后，得產物13.0克，收率99%， ESI-MS (M+I^): 749.47 (分子量748.43)。
1.5 Boc-D-Phe-Pro畫Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH的制備 冰浴下，將Boc誦D-Phe-OH (11.5克，43.5mmo1)和H-Pro陽Arg
(Pbf)國Pro畫Gly-Gly畫OMe (32.5克，43.5mmo1)溶于150mlTHF中， 加入PyBOP (21.5克，41.5mmol)， NMM (4.4克，43.5mmo1)，緩 慢升溫至室溫，反應2小時(TLC跟蹤反應過程)。反應完畢，減壓 蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析純化得41.0克Boc-D-Phe-Pro-Arg
(Pbf)國Pro-Gly國Gly-OMe，收率98%。將Boc國D-Phe-Pro國Arg (Pbf) -Pro隱Gly-Gly國OMe (10克，lOmmol)禾B NaOH (400毫克，lOmmol) 溶于50mlMeOH中，室溫攪拌2小時，減壓除去溶劑，剩余物用水 溶解，用1NHCl調pH值到1-2，有固體析出，過濾干燥得9.4克產 物，收率950/0， ESI-MS (M-H) 980.65 (分子量:981.63)。2、"片段B"中段全保護的6肽的合成。工藝過程如下:
Z-Asp(OtBu)-OH H隱Phe隱OMe.HCl
Z-Gly-OH H-Gly-OMe.HCl
DCC-HOBt-麗M
Z-Gly-Gly-OMe
j 2N NaOH/H+
Z-Gly,Gly-OH
'(I) HOSu-DCC r (2; H-Asn(Trt)-OH/NaHC03
Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH
j DCC-HOBt-麗M Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe j H2-Pd/C Z-Gly-OH H-Asp(OtBu)-Phe-OMe
+ HBTU-HOBt-NMM Z-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
I H2-Pd/C H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
HBTU-HOBt-NMM
Z-Gly-Gly-Asn-GIy-Asp(OtBu)-Phe-OMe I 2NNaOH/H+
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH
2.1 H-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制備
冰浴下，將Z-Asp (OtBu) -OH.H20 (30克，88mmol)和18.96 克(88mmol)的H-Phe-OMe HCl溶于250ml THF中，依次加入DCC
(18.12克，88.0mmol)、 HOBT (11.88克，88mmol)、 NMM (8.88 克，88mmol)，緩慢升溫至室溫反應2小時(TLC跟蹤反應過程)。 反應完畢后，過濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩余物用150ml乙酸 乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、 飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓 蒸去乙酸乙酯，得50克Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率88%。
室溫下，將Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe (50克，103.2mmol)和 10%Pd/C (3.75克)加入至150ml甲醇中，氫氣保護下反應2小時， 減壓除去溶劑，得27克產物，收率99%， ESI-MS (M+lT): 351.10
(分子量:349.85)。2.2 H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制備
冰浴下，將Z-Gly-OH (12.9克，57,lmmol)和H國Asp (OtBu) -Phe-OMe (20克，57. lmmol)溶于250ml THF中，加入HBTU(21.67 克，57.1mmol)， NMM (5.77克，57.1mmol)，緩慢升溫至室溫，反 應2小時(TLC跟蹤反應過程)。反應完畢后，減壓除去溶劑，剩余 物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸 氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥。濾除干 燥劑，減壓除去溶劑，剩余物柱層析純化得27克Z-Gly-Asp (OtBu) 畫Phe-OMe，收率90%。
室溫下，將Z畫Gly隱Asp (OtBu) -Phe隱OMe (27克，51.4mmo1) 和10%Pd/C (2.7克)加入至150ml甲醇中，氫氣保護下反應2小時， 減壓除去溶劑，得20.5克產物，收率99%， ESI-MS (M+Na+): 430.10 (分子量407.36)。
2.3 Z-Gly-Gly-OH的制備
冰浴下，將Z-Gly-OH (10克，48mmo1)和H-Gly-OMe HC1 (6 克，48mmol)溶于250ml THF中，依次加入DCC( 10.83克，53mmo1)、 HOBT (7.1克，53mmo1)和NMM (9.66克，96mmo1)。緩慢升溫至 室溫反應2小時(TLC跟蹤反應過程)。反應完畢后，過濾，收集濾 液，減壓除去溶劑，剩余物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽 和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用 無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物柱層析純化 得14克Z-Gly-Gly-OMe，收率93%。
將Z-Gly-Gly-OMe (4.9克，17.42mmo1)和NaOH (1.05克，26.1 mmol)，溶于50ml MeOH中，室溫攪拌2小時，減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，1NHCl調pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)， 合并有機相，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑，干燥后 得4.2克產物，收率90%。
2.4 Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH的制備
室溫下，將Z-Gly-Gly畫OH (8克，30.14mmo1)， HOSu (3.63克， 31.55mmol)， DCC (6.5克，31.55mmo1)溶于150mlTHF，攪拌反應 2小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，過濾，收集濾液。
室溫下，將H-Asn (Trt) -OH (14.53克，38.8mmol)， NaHC03 (6.52g， 77.6mmo1)溶于50mlTHF和50ml水的混合溶劑中，將上 一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續攪拌2小時。減壓除去溶 劑，用1NHCI調pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)，合并有機 相，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得20.9克產 物，收率87%。
2.5 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)畫Gly畫Asp (OtBu)國Phe-OH的制備 冰浴下，將Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH (8.42克，13.52mmo1)和
H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe (5.51克，13.52mmo1)溶于150mlTHF 中，依次加入DCC(2.93克，M.2mmo0、 HOBT(1.92克，14.2mmo1) 和NMM(1.34克，13.52mmo1)。緩慢升溫至室溫，反應2小時(TLC 跟蹤反應過程)。反應完畢后，過濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩 余物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳 酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥。濾除 干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物柱層析純化得11.94克 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)畫Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率87%。
將Z-Gly畫Gly畫Asn (Trt) -Gly畫Asp (OtBu)誦Phe-OMe (IO克，10mmol)， NaOH(1.2克，30mmol)，溶于100ml MeOH中，室溫攪拌 2小時，減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，用1NHCl調pH至3-4， 析出白色固體，濾集固體，干燥后得產物9.2克，收率91%， ESI-MS (M-H-): 999.25 (分子量1000.12)。
3、"片段C" C-端全保護8肽的合成。工藝過程如下
Z-Glu(OtBu)-OSu H-Glu(OtBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH j DCC-HOSu
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H-Tyr(tBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-OH H-Leu-OMe
+ DCC-HOBt Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)隱Leu-OMe ,H2-Pd/C
Z-Pro-OH H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
丄 DCC-HOBt
Z隱Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H國Ile-OH T
I i Z-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
H2-Pd/C
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile"OH H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
+ DCC-HOBt
Z-Glu(O氾u)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(Otfiu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
j H2-Pd/C
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
3.1 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH的制備
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -OH (101克，300mmol)， HOSu (44.5 克，300mmol)， DCC (68.0克，330mmol)溶于300ml THF,攪拌反 應2小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，過濾，收集濾液。
室溫下，將H畫Glu (OtBu)陽OH (60.9克，300mmol)， NaHC03(50.4克，600mmol)溶于200ml THF和200ml水的混合溶劑中，將 上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續攪拌2小時。減壓除去 溶劑，用IN HCl調pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有機相，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得142.9 克產物，收率92%。
3.2 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH的制備 室溫下，將Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(105.2克，200mmol)，
HOSu (33克，200mmol)， DCC (45.3克，220mmol)溶于200ml THF， 攪拌反應2小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，過濾，收集濾 液。
室溫下，將H-Tyr (tBu) -OH (57.46克，200mmol)， NaHC03 (33.6g， 400mmol)溶于150ml THF和150ml水的混合溶劑中，將 上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續攪拌2小時。減壓除去 溶劑，用1NHCl調pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有機相，用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得129.1 克產物，收率87%。
3.3 H國Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)畫Leu-OMe的制備 冰浴下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH (111.3
克，150mmo1)和H-Leu-OMe . HC1 (27.3克，150mmo1)溶于100ml THF,依次加入DCC(30.9克，150mmol)、 HOBT (20.2克，150mmo1) 和NMM(15.5克，150mmo1)。緩慢升溫至室溫，反應4小時(TLC 跟蹤反應過程)。反應完畢后，過濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩 余物用150ml乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、 飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物經柱層析純化得110.6克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率85%。
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (86.9克，lOOmmol)和腦Pd/C (3.6克)加入至150ml甲醇中，
氫氣保護下反應2小時，減壓除去溶劑后，得固體69.8克，收率95%,
ESI-MS (M+HO: 736.15 (分子量734.93)。
3.4 H-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe的
制備
冰浴下，將Z畫Pro-OH (12.5克，50mmo1)和H- Glu (OtBu)陽Glu (OtBu) -Tyr (tBu)隱Leu-OMe (36.7克，50mmo1)溶于100mlTHF 中，加入PyBOP (26克，50mmo1)， NMM (5克，50mmo1)。緩慢 升溫至室溫反應6小時(TLC跟蹤反應過程)。反應完畢后，減壓蒸 去溶劑，殘余物經硅膠柱層析純化得45.8克Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率94%。
室溫下，將Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (35克，36mmo1)和10% Pd/C (3.2克)加入至150ml甲醇中，氫 氣保護下反應3小時，減壓除去溶劑后，得產物28.7克，收率96%， ESI-MS (M+H"): 832.87 (分子量832,05)。
3.5 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH的制備
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH (26克，5Ommo1)， HOSu (5.75克，50mmol)， DCC (U.3克，55mmo1)溶于100mlTHF， 攪拌反應2小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，過濾，收集濾 液。
室溫下，將H-Ile-OH(6.6克，50mmol)， NaHC03(8.4g， lOOmmol)溶于30ml THF和30ml水的混合溶劑中，將上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續攪拌2小時。減壓除去溶劑，用IN HC1調pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(80mlX3)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得28.5克產物，收率90%。
3.6 H-Glu ( OtBu ) -Glu (OtBu ) -Ile-Pro-Glu ( OtBu) -Glu ( OtBu)-Tyr (tBu) -Leu-OMe的制備
冰浴下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH (12.7克，20mmo1)和H-Pro-Glu (OtBu)國Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu扁OMe (16.6克，20mmo1)溶于50ml DMF中，加入PyBOP (10.4克，20mmol)， NMM
(2克，20mmo1)。緩慢升溫至室溫反應12小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析純化后得24.3克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -lie-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)國Tyr
(tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)畫Tyr (tBu)誦Leu-OMe (20克，13.8mmol)禾卩10%Pd/C
(1.6克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護下反應6小時，減壓除去溶劑后，得產物16.5克，收率91%， ESI-MS (M+2lT): 658.67 (分子量1315.65)。
4、"片段B"與"片段C"縮合形成"片段D"。工藝過程如下
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH —H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe-l pyBop NMM
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-GIu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
,,HrPd/C
H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(O但u)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe冰浴下，將Z-Gly國Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)國Phe-OMe (8.2克，8.2mmo1)和H-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (10.8克，8.2mmol)溶于30ml DMF中，加入PyBOP (4.2克，8.2mmol)，菌M (0.8克，8.2mmol)。緩慢升溫至室溫反應24小時(TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱層析純化后得15.8克Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (OtBu)畫Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室溫下，將Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)-Leu-OMe， (14克，6mmo1)和10% Pd/C (0.8克)加入至30ml甲醇中，氫氣保護下反應8小時，減壓除去溶劑后，得產物11.9克，收率92%， ESI-MS (M+3H^): 722.27 (分子量:2163.62)。
5、"片段A"與"片段D"縮合。工藝過程如下
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH—H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-ne-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(氾u)-Leu-OMe」 p^op.薩
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
2N歸H/lT
Boc-D-Phe-Pra-Arg(Pbf)-PrO"Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe"Glu(OtBu>Glu(OtBu>Ile-PrO"Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(ffiu)-Leu-OH
TFA-TIS
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
冰浴下，將Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH (4.8克，4.9mmol)和H-Gly國Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe(10.6克，4.9mmol)溶于25ml DMF中，加入PyBOP (2.5克，，4.9mmol)。緩慢升纟顯至室溫反應24小時 (TLC跟蹤反應過程)，反應完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經硅膠 柱層析純化后得12.2克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly 陽Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) - Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)曙Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率80%。
在室溫下，將Boc誦D畫Phe-Pro-Arg(Pbf)國Pro畫Gly國Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe國Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)畫Tyr (tBu) -Leu畫OMe (10克，3.2mmol)和 NaOH (0.256克，6.4mmol)，溶于20ml MeOH中，室溫攪拌4小時， 減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，用1NHCl調pH至3-4，析出白色 固體，濾集固體，干燥后得9.3克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly隱Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)陽Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)畫Leu-OH，收率93%， ESI-MS (M-H'): 777.61 (分子量3113.74)。
將Boc-D-Phe-Pro國Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OH (6.3克，2mmo1)溶于冰浴冷卻的 200ml TFA/TIS (95:5)中，攪拌，逐漸升溫至室溫，反應2小時后 減壓除去溶劑，加入冰浴冷卻的500ml乙醚，得白色固體沉降，即為 比伐盧定粗品。經HPLC純化和冰凍干燥，得3.4克干粉比伐盧定， 純度98.5%，收率78%， ESI-MS (M+3tf): 778.31 (分子量2180.33)。
權利要求
1、比伐盧定的液相合成方法，其特征在于依次包含下列步驟首先，用液相法逐步合成三個全保護片段，即“片段A”，N-端全保護的6肽R1-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-OR3，“片段B”，中段全保護的6肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-OR3，“片段C”，C-端全保護的8肽R1-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；然后，將“片段B”和“片段C”縮合，得到“片段D”，即C-端全保護的14肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；接著，將“片段A”和“片段D”縮合，得到比伐盧定的全保護20肽R1-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；最后，脫除上述全保護20肽的所有保護基團R1～R5，得到比伐盧定的粗品，進一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu。
2、 根據權利要求1所述的比伐盧定的液相合成方法，其特征在于所述保護基團W RS優選——R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (芐氧羰基)，Fmoc (9-芴甲氧羰基)； R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)，Pmc (2，2，5，7，8-五甲 基苯并二氫吡喃-6-磺酰基)，Pbf (2,2，4,6,7-五甲基苯并二氫呋喃-5-磺酰基)，N02 (硝基)，Z (芐氧羰基)，Z2 (雙芐氧羰基)；R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分別為乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (芐基)； R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)； R5=Bzl (節基)，tBu (叔丁基)。
3、 根據權利要求1或2所述的比伐盧定的液相合成方法，其特 征在于脫除所述全保護20肽的所有保護基團的方法是，用堿脫除 C-末端保護，用酸脫除N-末端及所有側鏈保護基。
4、 根據權利要求3所述的比伐盧定的液相合成方法，其特征在 于用TFA-TIS溶液一次性脫除所述全保護20肽的兩端及側鏈的所 有保護基團。
5、 根據權利要求1或2所述的比伐盧定的液相合成方法，其特 征在于采用高效液相色譜對所述比伐盧定粗品進行純化。
全文摘要
本發明提供一種比伐盧定的液相合成方法。首先逐步合成三個全保護的片段N-端全保護的6肽、中段全保護的6肽、C-端全保護的8肽，然后將這三個片段依次縮合得到全保護的比伐盧定，最后脫除所有保護基團得到比伐盧定粗品，再經過高效液相色譜純化，得到比伐盧定純品。該方法不需要樹脂和大過量的保護氨基酸及縮合劑，易于實現規模化生產，且生產成本相對較低。
文檔編號C07K7/00GK101475631SQ20091002879
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月8日 優先權日2009年1月8日
發明者王良友, 黃仰青 申請人:蘇州中科天馬肽工程中心有限公司