本發明涉及一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備。

背景技術：

烏頭堿類二萜生物堿是烏頭屬植物中主要的活性成分，具有鎮痛、消炎、強心和抗癌等藥理作用。烏頭堿類二萜生物堿主要有3類：單酯型二萜生物堿、雙酯型二萜生物堿和脂型二萜生物堿，其中雙酯型二萜生物堿的毒性最大，其致毒劑量極小，且治療量與中毒量接近。在烏頭屬中藥材的生品中雙酯型二萜生物堿含量最高，所以生品藥用或食用前，都需要通過炮制以減毒增效，提高使用的安全性。生品藥的炮制減毒，實際是以水溶去除大部分生物堿和以水解將雙酯型生物堿轉化為單酯型生物堿的過程，藥材來源的差異與炮制過程的控制直接關系到藥材的質量評價。快速檢測出藥物或生物材料中雙酯型烏頭堿(DAC)的含量，精準把控烏頭屬中藥材應用時的療效與安全性，一直是烏頭屬中藥材研究中的難點。對于天然產物中含量低的一類物質，在定量分析時也較困難，目前采用的HPLC法或LC—MS法對儀器要求很高，檢測時的前期處理工作復雜，檢測靈敏度又無法滿足痕量檢測的要求。相比傳統色譜檢測方法，基于抗體與抗原或半抗原之間相結合的高度特異性及敏感性而建立起來的免疫分析法，對于微量痕量成分的準確快速檢測具有無法比擬的技術優勢。在微量痕量中藥成分的定性定量分析、中藥成分的體內藥代動力學研究中，免疫分析法已逐步得到應用，但在中藥質量控制領域卻鮮有報道。特異性DAc抗體是免疫分析法檢測DAC的前提，但目前還沒有商品化的特異性DAC抗體。DAC是小分子化合物，具有反應原性，沒有免疫原性，只有在與大分子的載體蛋白偶聯后才成為完全抗原而具有免疫原性。為此，本研究合成了DAC完全抗原并對其鑒定，以期為DAC免疫學檢測方法的建立奠定基礎。

技術實現要素：

本發明提出一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備方法。

一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

（1）分別精確稱取雙酯型烏頭堿10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL雙蒸水的溶液中，在室溫下避光、攪拌過夜，即為反應液A；

（2）精確稱取BSA25mg溶于3mLPBS，調節pH值至7-9；

（3）稱取18mgOVA溶于3mLPBS，將pH值調節至7.4，此為反應液B；

（4）將反應液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h內操作完畢，然后進行透析，經過離心處理后，純化后即得。

優選地，所述步驟（2）PH值為7.4。

優選地，所述步驟（4）操作時間為1.5h。

本發明所述方法制備的雙酯型烏頭堿，抗體的敏感性高、特異性強，本發明所述方法操作簡單，可工業化生產，實用性強。

具體實施方式

實施例1。

一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

（1）分別精確稱取雙酯型烏頭堿10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL雙蒸水的溶液中，在室溫下避光、攪拌過夜，即為反應液A；

（2）精確稱取BSA25mg溶于3mLPBS，調節pH值至7-9；

（3）稱取18mgOVA溶于3mLPBS，將pH值調節至7.4，此為反應液B；

（4）將反應液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h內操作完畢，然后進行透析，經過離心處理后，純化后即得。

實施例2。

一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

（1）分別精確稱取雙酯型烏頭堿10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL雙蒸水的溶液中，在室溫下避光、攪拌過夜，即為反應液A；

（2）精確稱取BSA25mg溶于3mLPBS，調節pH值至7-9；

（3）稱取18mgOVA溶于3mLPBS，將pH值調節至7.4，此為反應液B；

（4）將反應液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h內操作完畢，然后進行透析，經過離心處理后，純化后即得。

本實施例所述步驟（2）PH值為7.4。

實施例3。

一種雙酯型烏頭堿完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

（5）分別精確稱取雙酯型烏頭堿10mg、NHS5mg、EDC5mg，充分溶解于含1mLDMF和200μL雙蒸水的溶液中，在室溫下避光、攪拌過夜，即為反應液A；

（6）精確稱取BSA25mg溶于3mLPBS，調節pH值至7-9；

（7）稱取18mgOVA溶于3mLPBS，將pH值調節至7.4，此為反應液B；

（8）將反應液A逐滴加人B中，要求每5～10min加入200μL，在1-2h內操作完畢，然后進行透析，經過離心處理后，純化后即得。

本實施例所述步驟（2）PH值為7.4；所述步驟（4）操作時間為1.5h。