專利名稱：一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改良小麥品質(zhì)的方法，特別是涉及一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法。
小麥面粉由胚乳加工而成，胚乳主要由淀粉粒和種子貯藏蛋白組成。種子貯藏蛋白是決定面粉品質(zhì)的主要因素，根據(jù)其在不同溶劑的溶解度與在離解劑中分子大小主要分為醇溶蛋白(Gliadin)和麥谷蛋白(Glutenin)兩類。另外，還有麥清蛋白(Albumin)及麥球蛋白(Globulin)等，但含量較少。
醇溶蛋白約占總面筋蛋白的60％左右，分子量較小，為分子內(nèi)二硫鍵形成的單鏈蛋白單體，它決定面團(tuán)的延展性(extensibility)。醇溶蛋白的氨基酸組成極不平衡，它含有約一半的脯氨酸和谷氨酰胺，卻只有很少量的賴氨酸和色氨酸，從而導(dǎo)致谷物的賴氨酸和色氨酸含量偏低。醇溶蛋白又可分為三類高分子量(HMW)醇溶蛋白、貧硫醇溶蛋白和富硫醇溶蛋白。根據(jù)氨基酸組成不同，可分為α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白。α-、β-、γ-醇溶蛋白，含有2-3％的含硫氨基酸，即為富硫醇溶蛋白；ω-醇溶蛋白含硫極少即為貧硫醇溶蛋白。編碼醇溶蛋白的基因分別位于第一部分同源群(1A、1B、1C)染色體的短臂上，定名為Gli-1位點(diǎn)，編碼γ-和ω-醇溶蛋白的基因分別位于第六部分同源群(6A、6B、6C)染色體的短臂上，定名為Gli-2位點(diǎn)，編碼α-、β醇溶蛋白。
麥谷蛋白約占總面筋蛋白的40％，分子量較大，從數(shù)十萬到數(shù)百萬KD，由多肽鏈通過分子間二硫鍵和非共價(jià)鍵等分子間作用力連接形成異質(zhì)聚合體，它決定面團(tuán)的彈性(elasticity)。麥谷蛋白經(jīng)SDS處理后，可分成兩類亞基分子量為60-150KD的高分子量谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)和分子量為30-51KD的低分子量谷蛋白亞基(low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS)。編碼LMW-GS的基因位于第一部分同源群(1A、1B、1C)染色體的短臂上，與編碼醇溶蛋白的Gli-1位點(diǎn)緊密連鎖，分別定名為Glu-A3、Glu-B3、Glu-D3。特定的LMW-GS與特定的醇溶蛋白之間緊密連鎖。編碼HMW-GS的基因位于1A，1B和1D染色體長(zhǎng)臂著絲點(diǎn)遠(yuǎn)端，分別用Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1表示在1A、1B和1D上的三個(gè)位點(diǎn)。其中，亞基1的基因在1A上；亞基2-5，10和12的基因在1D上；亞基6-9的基因在1B上。每個(gè)基因位點(diǎn)由2個(gè)緊密連鎖的基因組成，分別編碼蛋白質(zhì)分子量較高的x型亞基和分子量較低的y型亞基(Payne，PI，et al，Correlation between theinheritance of certain high molecular weight subunits of glutenin and bread making in progenies ofsix crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric.3251-60，1981。Payne，PI，et al，Structural andgenetical studies on the high molecular weight subunits of wheat glutenin.Theor.Appl.Genet.63129-138，1982)。據(jù)此推論，六倍體普通小麥品種應(yīng)有6個(gè)不同的HMW-GS組成，但實(shí)際上一般小麥品種中僅有3-5個(gè)亞基。主要是由于在特定位點(diǎn)上的基因不表達(dá)或處于沉默狀態(tài)，不編碼y型亞基，如Glu-A1只編碼x型亞基，而Glu-B1位點(diǎn)有時(shí)編碼y型亞基的基因也不表達(dá)。這些HMW-GS基因之間存在著高度的同源性。它們的共同特點(diǎn)為①無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；②5’和3’端序列具很強(qiáng)的保守性；③5’和3’之間的結(jié)構(gòu)基因區(qū)的重復(fù)序列占66％-81％。
研究表明，HMW-GS在F1代表現(xiàn)為共顯性遺傳，但各亞基的量具有劑量效應(yīng)，呈傾母現(xiàn)象。這與谷類作物的胚乳性狀是由雙受精產(chǎn)生的三倍體(3n)直接相關(guān)，來自父母本的基因分別占1/3和2/3。HMW-GS開花后10天開始在小麥籽粒中形成，開花后15天可由電泳檢測(cè)到。
研究表明，HMW-GS蛋白質(zhì)分子的大部分幾乎都有PGQGQQ六肽和GYYPTSP(L)QQ九肽為重復(fù)單元組成的大段重復(fù)序列，這些肽段在空間的走向形成β轉(zhuǎn)角(β-turn)，有規(guī)則的β-轉(zhuǎn)角是HMW谷蛋白產(chǎn)生適宜彈性所必需的。HMW-GS在蛋白質(zhì)分子的N端和C端具有非重復(fù)的氨基酸序列，而中間的大部分是上述六肽和九肽重復(fù)單位。N端和C端含有Cys殘基，從而形成分子間二硫鍵，產(chǎn)生高分子量的線形聚合物，這些聚合物使得面團(tuán)具有良好的彈性。即面團(tuán)的彈性主要來自HMW-GS的六肽和九肽重復(fù)單位所形成的β-轉(zhuǎn)角和分子間的二硫鍵。
Payne等發(fā)現(xiàn)單個(gè)HMW-GS亞基1與面包烘烤品質(zhì)呈高度相關(guān)，并提出HMW-GS等位基因之間的影響具有加性效應(yīng)(Payne，PI，et al，Genetic of wheat storage proteins and theeffect of allelic variation on bread making quality.Ann.Rev.Plant Physiol.38141-153，1987.)。隨后又發(fā)現(xiàn)1D染色體編碼的Dx5和Dy10亞基與面包烘烤品質(zhì)呈顯著正相關(guān)，在HMW-GS中Glu-D1位點(diǎn)控制的亞基對(duì)烘烤品質(zhì)影響最大；Glu-B1位點(diǎn)編碼的亞基影響最小；Glu-A1位點(diǎn)(Ax1)控制的亞基(亞基1)的影響介于二者之間(Payne，PI，et al，Correlationbetween the inheritance of certain high molecular weight subunits of glutenin and bread making inprogenies of six crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric.3251-60，1981.)。Pogna等(Pogna，N，et al，Evidence for a direct caual effect of low molecur weight subunits og glutenin on glutenviscoelaticity in durum wheat.JCereal Sci.7211-214，1988)研究認(rèn)為優(yōu)質(zhì)基因Dx5+Dy10中的Dy10亞基是決定優(yōu)質(zhì)面包烘烤特性的亞基。而Rogers等(Rogers，WJ，et al，Effectionbread making quality of x-type and y-type high molecular weight subunits of glutenin.J.Cereal Sci.14209-221，1991)則認(rèn)為Dx5亞基和Dy10亞基一樣，在面包烘烤品質(zhì)中具有同樣重要的作用，但同樣證明Glu-D1位點(diǎn)對(duì)品質(zhì)的影響較Glu-B1大。眾多的研究表明，一般小麥品種含3-5個(gè)亞基，不同的亞基構(gòu)成方式直接關(guān)系到烘烤品質(zhì)質(zhì)量。HMW-GS 1Dx5和1Dy10基因與面包烘烤品質(zhì)呈顯著的正相關(guān)，具有Dx5+Dy10的品種明顯優(yōu)于具有其等位變異型亞基Dx2+Dy12或Dx3+Dy12的品種(Shewry，PR，etal High molecular weightsubunits of wheat glutenin.JCereal Sci.15105-120，1992。趙和等，小麥高分子量麥谷蛋白亞基的研究動(dòng)態(tài)。國(guó)外農(nóng)學(xué)——麥類作物，443-45，1993)。
我國(guó)小麥面粉的烘烤品質(zhì)普遍較差，其主要原因是面筋含量低，面筋質(zhì)量差。從國(guó)外引進(jìn)的面包小麥雖然面筋質(zhì)量?jī)?yōu)良，但由于地域差異，不僅產(chǎn)量低，而且病害嚴(yán)重。
目前，常規(guī)的雜交育種方法仍是最為有效的獲得新品種的方法。近代發(fā)展起來的其它育種方法如遠(yuǎn)緣雜交育種、輻射育種，單倍體育種等等在小麥的種質(zhì)與品種改良中起了一定的推動(dòng)作用。但這些方法由于自身的局限性，因而作用范圍十分有限。
利用遠(yuǎn)緣雜交方法可能開發(fā)和利用來自小麥近源野生種屬中的優(yōu)良野生基因，通過染色體的附加，削減和代換以及進(jìn)一步的染色體易位從而大大豐富小麥的種質(zhì)與基因庫(kù)。但由于遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，種子無生命力不育，后代性狀分離大、時(shí)間長(zhǎng)、極不易穩(wěn)定等致命弱點(diǎn)，即使成功易位，由于易位染色體片段長(zhǎng)度大小無法控制，在通過染色體工程方法轉(zhuǎn)移獲得優(yōu)良目的性狀與基因的同時(shí)，也會(huì)將許多不良的野生基因與性狀帶給小麥，很難在生產(chǎn)上直接推廣利用。
隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及基因克隆技術(shù)和重組DNA技術(shù)的建立與漸趨完善，利用植物基因工程方法和以多種分子標(biāo)記方法為主體的分子標(biāo)記輔助選擇育種為手段，直接在分子水平開展植物的品種改良已逐步成為現(xiàn)實(shí)和可能，稱為“分子育種”，它是以微觀水平的核酸、蛋白質(zhì)、酶、乃至單個(gè)基因等的差異作為“性狀”來考察研究與改良。與“傳統(tǒng)育種”方法相比，“分子育種”來得更為直接、準(zhǔn)確、可靠，展示在育種家面前的是植物種質(zhì)或育種后代材料更深層次分子水平性狀的差異。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，是將面包小麥的高分子量谷蛋白亞基5與10的基因Dx5和Dy10導(dǎo)入栽培小麥中。
與所述Dx5和Dy10基因一同導(dǎo)入栽培小麥中的還有編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因。
除草劑草丁膦(又稱為膦化麥黃酮，商品名，Basta，主要成分為PPT)是一種非選擇性滅生除草劑，為谷氨酰胺類似物，它可有效阻斷與抑制植物谷氨酰氨合成酶(GS)的作用，從而造成NH4+的大量積累，使植物細(xì)胞氨中毒死亡。Bialaphos是含PPT的三肽(2個(gè)丙氨酸殘基和1個(gè)PPT殘基)，它的作用與PPT類似，但更為有效，用量可大大降低。從潮濕鏈霉菌分離出來的bar基因所編碼的PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，可以乙酰輔酶A為輔助因子，使PPT和Bialaphos乙酰化而失去抑制GS活性的作用。
本發(fā)明以bar基因?yàn)檫x擇基因，將其導(dǎo)入小麥可使小麥具有PPT抗性而免受傷害。
上述的bar基因可以以包括其內(nèi)含子的玉米Ubi1啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)bar基因的表達(dá)，也可以以包括其內(nèi)含子的水稻Actin啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)bar基因的表達(dá)。
所述導(dǎo)入基因Dx5和Dy10的外植體為栽培小麥的幼胚、幼穗、花藥或胚性愈傷組織。
在導(dǎo)入Dx5和Dy10時(shí)以編碼葡萄糖苷酸酶的GUS基因?yàn)閳?bào)告基因。
被導(dǎo)入的Dx5和Dy10優(yōu)選取自面包小麥Cheyenne。
導(dǎo)入Dx5和Dy10的栽培小麥優(yōu)選為京花1號(hào)、京冬6號(hào)、京411、豐抗8號(hào)、京單2097或京單1744。
基因Dx5和Dy10在Genbank中的登記號(hào)分別為X12928，X12929。
植物基因工程技術(shù)與方法的發(fā)展為小麥面包烘烤品質(zhì)性狀的改良提供了其它方法所無法比擬的全新途徑，通過基因工程方法將來自面包小麥與近緣野生種的優(yōu)質(zhì)HMW-GS導(dǎo)入小麥優(yōu)良品種，在不影響小麥產(chǎn)量和抗病性的前題下，可使小麥品種性狀大大改善，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
用本發(fā)明的方法將HMW-GS優(yōu)質(zhì)亞基基因?qū)氩⒄系叫←溁蚪M，改良小麥的烘烤品質(zhì)，目標(biāo)單一，無不利基因的連鎖問題，無種屬的限制，已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)含量明顯提高，面粉烘烤品質(zhì)性狀和質(zhì)量得到了較大改善。用于導(dǎo)入的目的基因可來自任何生物種，同時(shí)可利用當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣的優(yōu)良品種為受體，轉(zhuǎn)基因植物能夠直接在生產(chǎn)上利用。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖2為藍(lán)白斑篩選圖譜。
圖3為重組質(zhì)粒構(gòu)建與pBPC24示意圖。
圖4為HMW-GS Dx5和Dy10基因表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBPC30。
圖5為HMW-GS Dx5和Dy10基因表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBPC31。
圖6顯示基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼穗的篩選與抗性愈傷組織的分化。
圖7顯示自小麥幼穗篩選分化獲得的轉(zhuǎn)基因小麥植株。
圖8為基因槍轉(zhuǎn)化小麥花藥GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果。
圖9為轉(zhuǎn)基因植株bar基因PCR鑒定結(jié)果。


圖10為bar基因的Southern雜交分析。
圖11為HMW-GS基因的Southern雜交分析。
圖12為轉(zhuǎn)基因小麥植株的點(diǎn)雜交分析結(jié)果。
圖13 SDS-PAGE分析HMW-GS亞基基因的表達(dá)。
圖14為轉(zhuǎn)基因株系面粉的粉質(zhì)圖。
2、外植體幼穗(二棱末期—小花原基分化)；花藥(單核靠邊期)；幼胚(開花后12-15天)；胚性愈傷組織。
3、質(zhì)粒pSP72(Promega)；pBluescript(Stratagene)；pAHC25；pBARGUS。
4、大腸桿菌菌株DH5α；JM109(Promega)。
5、試劑酶類(國(guó)產(chǎn)，華美公司；進(jìn)口，Promega，BM，Biolabs)；地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒(BM)；地高辛化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(BM)。
6、基因槍JQ700火藥基因槍；高壓放電基因槍；PDS-1000/He(BioRad)。
7、培養(yǎng)基A.幼穗接種培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基，加2，4-D 2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.8。
B.花藥接種培養(yǎng)基W14培養(yǎng)基，加2，4-D 2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，蔗糖100g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.5。
C.幼胚接種培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基，加2，4-D 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.8。
D.篩選繼代培養(yǎng)基據(jù)不同接種外植體和過程，在上述培養(yǎng)基中添加Basta2-25mg/L或Bialaphos 0.5-8mg/L。
E.分化篩選培養(yǎng)基IMS基本培養(yǎng)基，添加玉米素10mg/L，IAA 1mg/L，Basta0.5mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.8。
F.分化篩選培養(yǎng)基IIMS基本培養(yǎng)基，添加玉米素1mg/L，IAA 1mg/L，Basta0.5mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.8。
G.壯苗培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基，加IAA 10mg/L，蔗糖80g/L，瓊脂粉7g/L；pH5.8。
8、GUS基因表達(dá)的檢測(cè)標(biāo)記基因GUS(編碼葡萄糖苷酸酶)用作報(bào)告基因，通過其瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果推測(cè)轉(zhuǎn)化體系的效率。起作用底物為X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸)。GUS基因檢測(cè)染色溶液組成成分為0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，10mMEDTA-Na2，5mM K3[Fe(CN)6]，5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1％Triton X-100，0.1％(W/V) X-Gluc，過濾滅菌，-20℃保存。將轉(zhuǎn)化后3-7天的材料進(jìn)行GUS染色以檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)效率，或?qū)⑥D(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行GUS染色以檢測(cè)其是否穩(wěn)定表達(dá)。染色方法是，將材料置于GUS檢測(cè)染色液中，37℃黑暗下24小時(shí)，然后用70％乙醇或FAA固定液脫色。
實(shí)施例1、HMW-GS亞基基因的克隆與質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、克隆基因引物的設(shè)計(jì)根據(jù)HMW-GS基因序列設(shè)計(jì)1Dx5基因上游引物為5’CTACTCGAGA TGCTTAGAAGCTTTGAG3’(27bp)；下游引物為5’CATGAGCTCA TTATTACTGG GCTTTAC3’(27bp)。1Dy10基因上游引物為5’TCCTCTAGAC GACATGCTTA GAAGCTTTTA G3’(31bp)；下游引物為 5’CTTGAGCTCT ATTATTGGGT TTTACTCTAG3’(30bp)。
2、PCR反應(yīng)與克隆以面包小麥品種Cheyenne的總DNA為模板，分別用1Dx5和1Dy10基因的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)克隆目的基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)域，反應(yīng)體系50ul10xbuffer 5ul；2mMdNPT 5ul；25mMMgCl2 4ul；50uM上下游引物各1ul；模板DNA(1ug/ul)1ul；Taq DNA聚合酶2.5U；加ddH2O補(bǔ)至50ul。PCR反應(yīng)條件為95℃5分鐘，95℃1分鐘，55℃30秒，72℃3分鐘，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物上樣電泳(0.8％瓊脂糖)，分別回收1Dx5 3.1kb和1Dy10 2.5kb的目的片段條帶，如
圖1所示，帶A，B為1Dx5基因，帶C為1Dy10基因，帶M為Gibco公司1kb DNA marker。用Promega DNA純化試劑盒(A7280)純化并溶于50ul ddH2O。
純化的目的片段由于Taq酶特性而帶有3’dA，可直接插入pGEM-T載體，篩選白斑(如圖2所示)獲得的克隆經(jīng)酶切分析鑒定，并進(jìn)行逐步分段測(cè)序，獲得序列正確無誤目的基因的克隆，分別定名為pT1Dx和pT1Dy。
3、表達(dá)載體的克隆與構(gòu)建質(zhì)粒提取，純化，酶切，瓊脂糖電泳，轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞制備，基因連接與篩選等方法參見《分子克隆》(Maniatis等，1989)。
農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS 3`末端終止子(0.26kb)序列由pBI221用SacI和EcoRI雙酶切回收，插入pSP72(Promega)的SacI和EcoRI位點(diǎn)，用藍(lán)白斑篩選法獲得質(zhì)粒pBPC18(2.7kb)(如圖2所示)。HMW-GS 1Dx5基因從pT1Dx用XhoI和SacI雙酶切分離回收，插入質(zhì)粒pBPC18(S)的XhoI和SacI位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pBPC21(5.8kb)；HMW-GS基因1Dy10從質(zhì)粒pT1Dy用XbaI和SacI雙酶切插入pBPC18的XbaI和SacI位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pBPC22(5.3kb)。1Dx5-NOS片段(3.3kb)從pBPC21用XhoI/EcoRI切下插入pBlueKS(Stratagene)的XhoI/EcoRI位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pBPC23(6.3kb)。質(zhì)粒pBPC22用XbaI/EcoRI酶切回收2.7kb片段，插入pBPC23的XbaI/EcoRI位點(diǎn)，即獲得編碼HMW谷蛋白亞基5和10的重組質(zhì)粒pBPC24(9.0kb)(如圖3所示)。
以編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因?yàn)闃?biāo)志基因，質(zhì)粒pBARGUS用HindIII酶切，Klenow酶補(bǔ)平2bp(dG，dA)，回收2.0kb片段，該片段含CaMV35S啟動(dòng)子+玉米Adh1內(nèi)含子(0.55kb)+bar基因+NOS3`終止子(0.26kb)，插入pBPC24經(jīng)XbaI酶切并補(bǔ)平2bp(dC，dT)的位點(diǎn)，獲得正向、反向插入的重組質(zhì)粒pBPC30f(11kb)和pBPC30r(如圖4所示)。
組成型表達(dá)啟動(dòng)子玉米Ubi1(Christensen，A.H.，et al，Plant Molec.Biol.18675-689，1992)和內(nèi)含子片段(2.0kb)從pAHC25分離，并構(gòu)建分離回收得到2.86kb片段，含Ubi啟動(dòng)子+bar基因+NOS3`終止子序列，插入pBPC24獲得重組質(zhì)粒pBPC31(如圖5所示)。
同時(shí)選擇玉米Ubi1啟動(dòng)子與內(nèi)含子(pBPC30)和CaMV35S啟動(dòng)子與Adh1內(nèi)含子(pBPC31)來驅(qū)動(dòng)編碼除草劑PPT抗性的bar基因，將有助于提高bar基因在小麥中的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)化選擇效果。
玉米Ubi1啟動(dòng)子水稻Actin啟動(dòng)子CaMV 35S啟動(dòng)子實(shí)施例2、基因槍轉(zhuǎn)化不同的外植體及植株再生1、微粒子彈的準(zhǔn)備稱取60mg金粉(BioRad，1μm直徑)或鎢粉(M10)于1.5ml離心管中，加1ml70％乙醇，用旋渦混合器或超聲波充分震蕩混合，10000rpm離心5分鐘，去上清，用無菌重蒸水重復(fù)洗3次，加入1ml50％的無菌甘油，并用渦旋混勻。取50μl上述制備的金粉或鎢粉顆粒至一無菌離心管中，順序加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 2.5MCaCl2和50μl 0.1M亞精胺(現(xiàn)配)；將混合物渦旋10分鐘，10000rpm離心5分鐘，去上清液。用70％乙醇和100％乙醇各洗沉淀1次，最后用48μl100％乙醇重新懸浮顆粒并用超聲波粉碎儀處理5秒，分散顆粒。
2、轉(zhuǎn)化幼穗第一年度，先將京花1號(hào)與京411兩個(gè)品種的幼穗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過一個(gè)月，形成愈傷組織，挑選愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含2mg/L Bialaphos的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行5次繼代抗性篩選(20天繼代1次)和分化。結(jié)果從品種京花1號(hào)轉(zhuǎn)化的254塊愈傷組織中，有2塊愈傷組織經(jīng)胚胎發(fā)生途徑而分化，最終獲得了14棵轉(zhuǎn)基因植株，其中11棵轉(zhuǎn)基因植株已種植到T5代。品種京411轉(zhuǎn)化后經(jīng)過抗性篩選，未得到分化的抗性再生植株(見表1)。
第二年度，轉(zhuǎn)化了京花1號(hào)、京411和2097三個(gè)品種的幼穗，質(zhì)粒為pBPC30；經(jīng)過除草劑抗性篩選和抗性愈傷組織分化(Bialaphos，2-5mg/L)，分別獲得了26、1和5棵抗性植株如表2及圖6、圖7所示，頻率分別為2.8％，0.16％，0.68％(株/叢)。
表1基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼穗愈傷組織的結(jié)果

表2基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼穗的結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，不同基因型之間，轉(zhuǎn)化效率有較大的區(qū)別。要提高小麥幼穗的轉(zhuǎn)化頻率，需要選擇較易轉(zhuǎn)化的品種。
3、轉(zhuǎn)化小麥花藥由于花粉母細(xì)胞為單細(xì)胞，轉(zhuǎn)化體存在嵌合性的可能性小，因而，具有其它組織不可比擬的優(yōu)越性。實(shí)驗(yàn)選用京花1號(hào)和京411兩個(gè)品種，取單核靠邊期的花藥接種3天后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒為pAHC25和pPBC30。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加Bialaphos 2mg/L；分化培養(yǎng)基中附加Bialaphos 0.5mg/L。用pAHC25質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的花藥，7天后用X-gluc檢測(cè)，瞬時(shí)表達(dá)極強(qiáng)(如圖8所示)。用質(zhì)粒p5B10A/35I轉(zhuǎn)化后在30-32℃進(jìn)行誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)1個(gè)月，然后在26-28℃下培養(yǎng)，分化在25℃下進(jìn)行，最終從京花1號(hào)獲得了白苗和綠苗各1株(如表3所示)。從研究結(jié)果可以看出，不同基因型之間的花藥培養(yǎng)再生頻率差異相當(dāng)大，是以花藥作為轉(zhuǎn)化受體的弱點(diǎn)。
表3基因槍轉(zhuǎn)化小麥花藥的結(jié)果

4、轉(zhuǎn)化小麥幼胚用質(zhì)粒pBPC30和pBPC31轉(zhuǎn)化京花1號(hào)、京411、豐抗8號(hào)、京1744、京冬6號(hào)和京411等5個(gè)品種的幼胚共6780個(gè)，經(jīng)過篩選和分化，共獲得了334株轉(zhuǎn)基因植株，占總接種數(shù)的4.9％(如表4所示)。從表4中可以看出不同品種幼胚的愈傷形成率和綠苗分化率差異均很大，變化幅度分別為0.2％-80.4％和0％-12.8％。其中豐抗8號(hào)最差，接種860個(gè)幼胚，僅形成2塊愈傷組織，沒有根與綠苗的分化；京1744次之，接種850個(gè)幼胚，形成192塊愈傷組織，誘導(dǎo)率為22.4％，不過最終僅分化出1棵抗性綠苗。京411和京冬6號(hào)的愈傷形成率與抗性綠苗分化率均較高，分別為80.4％、34.7％與12.8％、11.9％。
表4基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的篩選與愈傷組織的分化

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因小麥植株的PCR鑒定根據(jù)目的基因DNA序列設(shè)計(jì)如下引物1、1Dx5基因的上游引物Dx555’GCC TAG CAA CCT TCA CAA TC3’；下游引物Dx535’GAA ACC TGC TGC GGA CAA GT3’；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出452bp片段。
2、1Dy10基因的上游引物Dy1055’GTT GGC CGG TCG GCT GCC ATG3’；下游引物Dy1035’TGG AGA AGT TGG ATA GTA CC3’；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可克隆出567bp和1348bp兩條帶。
3、bar基因上游引物5’CCATCGTCAA CCACTACATC GAG3’(23bp)；下游引物5’CTGAAGTCCA GCTGCCAGAA AC3’(22bp)；陽(yáng)性植株可克隆出440bp片段。
采用bar基因，1Dx5和1Dy10基因進(jìn)行PCR反應(yīng)，如圖9所示，最終從587棵轉(zhuǎn)基因植株鑒定出328株為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55％，圖中M1kb plus DNA marker；PpBPC30質(zhì)粒DNA；N非轉(zhuǎn)化陰性CK；1-9轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植物的Southern雜交鑒定分析1、bar基因?yàn)樘结樀蔫b定分析10μg植物DNA用BamHI和HindIII酶切消化，以λDNA/HindIII/EcoRI為標(biāo)樣；未轉(zhuǎn)化的正常株(京花1號(hào)，京411)為陰性對(duì)照；質(zhì)粒pBPC30被HindIII酶切的樣品為陽(yáng)性對(duì)照，用地高辛DIG標(biāo)記的bar基因作探針，用1％Agarose膠電泳(EB 0.5μg/ml，電壓1V/cm)；將膠置于0.25N HCl中脫嘌呤15分鐘，重蒸水洗2次；立即用785型真空吸印儀(BioRad)轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，轉(zhuǎn)移液為0.5N NaOH，0.6N NaCl，真空吸壓5英寸Hg柱，轉(zhuǎn)印90分鐘。2xSSC洗膜5分鐘，80℃真空烤膜2小時(shí)。如圖預(yù)雜交液為5xSSC；2％封閉劑；0.02％SDS；0.1％(W/V)肌酸鈉；50％甲酰胺；100μg/ml經(jīng)變性與超聲波打斷的鯡魚精DNA，雜交溫度42℃。預(yù)雜交1-2小時(shí)，雜交液的探針濃度20-200ng/ml，雜交時(shí)間6-24小時(shí)。信號(hào)檢測(cè)用化學(xué)發(fā)光試劑盒(DIG-抗體，CSPD，BM)方法，X光片曝光。
結(jié)果如
圖10所示，其中帶1pBPC30；帶2京花1號(hào)CK；帶3-7轉(zhuǎn)基因植株。
2、HMW-GS Dx5基因片段為探針的鑒定分析轉(zhuǎn)基因植株與CK的總DNA經(jīng)XbaI/EcoRI酶切后進(jìn)行電泳，并以DIG標(biāo)記的λDNA/HindIII/EcoRI為標(biāo)樣；未轉(zhuǎn)化的正常株(京花1號(hào)，京411)為陰性對(duì)照；質(zhì)粒pBPC30經(jīng)XbaI/EcoRI酶切的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。用地高辛DIG標(biāo)記的HMW谷蛋白亞基5基因?yàn)樘结槪M(jìn)行電泳，結(jié)果如
圖11所示，其中帶1為陽(yáng)性的DNA分子標(biāo)記λDNA/HindIII/EcoRI，較為清晰；帶2為質(zhì)粒pBPC30經(jīng)XbaI/EcoRI酶切的樣品，為陽(yáng)性對(duì)照；帶3為京花1號(hào)非轉(zhuǎn)化的陰性CK，僅有緊相鄰的2條帶，片段大小為3.5Kb左右，這2條帶推斷為內(nèi)源HMW-GS亞基基因的條帶。用于檢測(cè)的17棵轉(zhuǎn)基因植株(帶4-帶20)中14棵有4條帶，兩兩緊密相連，在3.5Kb左右的兩條帶應(yīng)為HMW-GS內(nèi)源亞基，分布在4.5Kb和5.0Kb左右的兩條帶應(yīng)為導(dǎo)入的新亞基。轉(zhuǎn)基因植株中額外多出的2條帶，可確定是1Dx5和1Dy10亞基基因插入的結(jié)果。表明外源HMW-GS亞基5和10已整合到了基因組上。
實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因植物的點(diǎn)雜交鑒定分析將用質(zhì)粒pAHC25轉(zhuǎn)化幼穗、幼胚獲得的16株轉(zhuǎn)基因植株與用質(zhì)粒pBPC30轉(zhuǎn)化得到的21株轉(zhuǎn)基因植株分別提取總DNA。取植物DNA5μl(5μg)，加5μl 0.4N NaOH，10μl20xSSC，混勻變性5分鐘，點(diǎn)樣于尼龍膜上，80℃烤膜2小時(shí)。用地高辛(DIG，BM)標(biāo)記0.5kb的bar基因作為探針進(jìn)行點(diǎn)雜交，雜交結(jié)果如
圖12所示，其中A1pBSK質(zhì)粒(1ug)；D6-D10pBPC30 100pg-0.1pg；A2-A7京411(A2為CK，A3-A7為轉(zhuǎn)基因植株，各5ug)；A8-D5京花1號(hào)(A8為CK，A9-D5為轉(zhuǎn)基因植株，各5ug)點(diǎn)雜交結(jié)果表明，對(duì)照植株為陰性，轉(zhuǎn)基因植株之中陽(yáng)性率達(dá)75％。
實(shí)施例6、SDS-PAGE電泳鑒定HMW-GS基因的表達(dá)1、小麥種子蛋白的提取樣品提取緩沖液成分，66mM Tris，pH6.8，3％(W/V)SDS，3％(V/V)甘油，0.05％(W/V)溴酚蘭，2％(V/V)β巰基乙醇。取2粒種子壓磨碎后，加0.8ml樣品提取緩沖液，充分震蕩混勻。室溫靜置1小時(shí)，100℃水浴中提取5-10分鐘(或在70℃下保溫5-8小時(shí))。樣品以5000rpm離心2分鐘，將上清液吸取至另一1.5ml離心管，供點(diǎn)樣用。
2、SDS-PAGE蛋白電泳配制丙烯酰胺濃度為10％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，1)分離膠緩沖母液(4x)pH8.8，1.5mol/L Tris-HCl，0.4％SDS。
2)濃縮膠緩沖母液(4x)pH6.8，0.5mol/L Tris-HCl，0.4％SDS。
3)SDS-PAGE電極緩沖液pH8.3，192mmol/L甘氨酸，25mmol/LTris，0.1％SDS。
4)染色液45％甲醇，10％乙酸，0.25％考馬斯亮藍(lán)R-250。
5)脫色液20％甲醇，6％乙酸。
6)10％分離膠4.0ml分離膠緩沖母液，5.3ml Arc/Bis(29.20.8)，6.7ml H2O，0.1ml 10％過硫酸氨，0.008ml TEMED。
7)5.4％濃縮膠1.25ml濃縮膠緩沖母液，0.9ml Arc/Bis(29.20.8)，3.0ml H2O，0.015ml 10％過硫酸氨，0.005ml TEMED。
用美國(guó)BioRad公司產(chǎn)的ProteanIIxi型16cm長(zhǎng)電泳槽，制0.75cm厚膠，上點(diǎn)樣40ul，先用100V預(yù)電泳0.5小時(shí)，再用20V電壓電泳24-36小時(shí)。取出凝膠用5％三氯乙酸固定30分鐘，考馬斯亮藍(lán)染色0.5-2小時(shí)，脫色處理5-12小時(shí)。
對(duì)60個(gè)用本發(fā)明方法得到的T2代單株的種子蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果如
圖13所示，8株種子蛋白中有1Dy10基因的表達(dá)，4個(gè)株系同時(shí)有1Dy10和1Dx5亞基基因的表達(dá)，圖中，M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1面包小麥Cheyenne；2中國(guó)春；3京冬TG4-13；4京花TG3-74；5京花TG1-35；6京花1號(hào)；7加麥。
實(shí)施例7、轉(zhuǎn)基因小麥后代種子品質(zhì)性狀分析用Brabender型Experimental Mill Quadrumat Junior磨磨碎20g轉(zhuǎn)基因小麥植株和對(duì)照植株的種子，磨出面粉，再過100目篩，篩動(dòng)90秒，速度200轉(zhuǎn)/分。稱取面粉重，并計(jì)算出粉率出粉率％＝面粉重/籽粒重×100；同時(shí)，用蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定籽粒總蛋白含量與面粉蛋白含量。采用Zeleny微量法測(cè)定面粉的沉降值(Sedimentation Value)。
對(duì)102個(gè)用本發(fā)明方法得到的轉(zhuǎn)基因后代株系小麥種子蛋白品質(zhì)性狀進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示表5部分轉(zhuǎn)基因小麥T4代種子品質(zhì)分析結(jié)果

從表中的結(jié)果可以看出，有5個(gè)株系的沉降值與對(duì)照面包小麥品種Cheyenne(48.0)相當(dāng)或略優(yōu)(44.2-49.0)，有3個(gè)株系的20分鐘沉降值(32-33.6)高于Cheyenne(31.4)。25個(gè)京花1號(hào)的轉(zhuǎn)基因后代株系中，有9個(gè)株系的5分鐘沉降值變幅為29.4-46.1，與對(duì)照京花1號(hào)的26.9相比，提高了9.3-74.3％；7個(gè)株系的20分鐘沉降值變幅為26.2-33.6，與對(duì)照京花1號(hào)的22.4相比，提高了17-50％，同時(shí)籽粒總蛋白含量由11.6％提高為12.8％-15.1％，總蛋白增加10.3-30.2％；面粉蛋白含量由9.7％升高至10.7％-14.4％，增加26.3-48.5％。另有5個(gè)株系的面粉沉降值顯著低于對(duì)照。26個(gè)京冬6號(hào)的轉(zhuǎn)基因后代株系中，有10個(gè)株系的5分鐘沉降值和20分鐘沉降值變幅分別為37.1-49和25.9-32，分別比對(duì)照京冬6號(hào)的30.7和23.4提高20.9-59.6％和10.7-36.8％。因此可以得出結(jié)論，轉(zhuǎn)化株系的面包烘烤品質(zhì)改善效果十分顯著。
實(shí)施例8、轉(zhuǎn)基因株系面粉的粉質(zhì)圖分析對(duì)部分轉(zhuǎn)基因小麥株系T5種子的面粉品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，具體方法是用Brabender公司的粉質(zhì)儀(Farinograph)測(cè)定轉(zhuǎn)基因小麥株系面粉的面團(tuán)柔和性能，測(cè)定方法采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14614-93和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)IS05530-1-1988。結(jié)果如
圖14所示，圖中a京花1號(hào)(陰性對(duì)照)；b京411(北京地區(qū)當(dāng)前區(qū)試對(duì)照)；c京冬8號(hào)(陰性對(duì)照)；dTG1-28d(來自京花1號(hào))；eTG3-76b(來自京花1號(hào))；fTG5-99(來自京冬8號(hào))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照京花1號(hào)，京411的面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間僅為3分鐘左右。而轉(zhuǎn)基因株系TG5-23b的面團(tuán)穩(wěn)定維持時(shí)間為16分鐘，TG1-28d，TG3-76b，TG5-98，和TG5-99的面團(tuán)穩(wěn)定維持時(shí)間高達(dá)30分鐘以上，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)面包小麥的要求標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例9、轉(zhuǎn)基因小麥后代的遺傳與變異采用幼葉葉片涂抹除草劑的方法，鑒定除草劑抗性bar基因在轉(zhuǎn)基因植株T1和T2代75個(gè)轉(zhuǎn)基因后代株系的表達(dá)。田間播種40天，取單株的葉片用10mg/L的Bialaphos進(jìn)行涂抹處理，處理10-15天后觀察植株葉片對(duì)除草劑抗性的反應(yīng)，確定bar基因抗性的分離規(guī)律。結(jié)果表明，bar基因的遺傳基本符合孟德爾3∶1分離比例。T1代檢測(cè)的抗性與非抗性的比例為61∶14。T2代植株中，來自14個(gè)無抗性的株系，仍無抗性；來自具有抗性部分的后代，23個(gè)株系，抗性能穩(wěn)定遺傳，另外38株系出現(xiàn)了分離現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，是將面包小麥的高分子量谷蛋白亞基5與10的基因Dx5和Dy10導(dǎo)入栽培小麥中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于與所述Dx5和Dy10基因一同導(dǎo)入栽培小麥中的還有編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于以包括其內(nèi)含子的玉米Ubi1啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)bar基因的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于以包括其內(nèi)含子的水稻Actin啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)bar基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于所述導(dǎo)入基因Dx5和Dy10的外植體為栽培小麥的幼胚、幼穗、花藥或胚性愈傷組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于以編碼葡萄糖苷酸酶的GUS基因?yàn)閳?bào)告基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于所述面包小麥為Cheyenne。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于所述栽培小麥為京花1號(hào)、京冬6號(hào)、京411、豐抗8號(hào)、京單2097或京單1744。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程手段改良小麥烘烤品質(zhì)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種改良小麥烘烤品質(zhì)的方法，是將面包小麥的高分子量谷蛋白亞基5與10的基因Dx5和Dy10導(dǎo)入栽培小麥中。與所述Dx5和Dy10基因一同導(dǎo)入栽培小麥中的還有編碼抗除草劑PPT與Bialaphos的bar基因。用本發(fā)明的方法將HMW－GS優(yōu)質(zhì)亞基基因?qū)氩⒄系叫←溁蚪M，改良小麥的烘烤品質(zhì)，目標(biāo)單一，無不利基因的連鎖問題，無種屬的限制，已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)含量明顯提高，面粉烘烤品質(zhì)性狀和質(zhì)量得到了較大改善。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1443848SQ02104080
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者張曉東, 陳緒清, 楊鳳萍, 梁榮奇, 韓立新 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心