專利名稱：一種蘿卜系胼胝體和用它培育植物體及雜交種子的方法
技術領域：
本發明是關于新基因型的CMS蘿卜系的胼胝體，并由此生產植物體和雜交種子的方法，進一步涉及上述NWB-CMS蘿卜系的植物體選擇用DNA標記；尤其涉及一種包括序列號碼5或者6的堿基序列的NWB-CMS蘿卜系的胼胝體，利用它培育植物體和生產雜交種子的方法，以及擁有以序列號碼5或者6表示的堿基序列為特點的NWB-CMS蘿卜系的有關植物體選擇用DNA標記的內容。
背景技術：
雄性不育(male sterility)是花粉，花粉囊，雄蕊等雄性器官異常而產生不育的現象。雄性不育有基因原因和環境原因，在雄性器官里花粉的不育發生的情況最多。發生花粉不育的基因原因是染色體發生異常而花粉母細胞的減數分裂發生混亂，以及細胞核內的基因或細胞質基因(cytoplasmicfactor)的突變細胞發生異常而花粉在成熟過程中被破壞。
由于花粉母細胞的減數分裂發生混亂而造成的雄性不育，其雌性器官也發生異常；而花粉在成熟過程中被破壞造成的雄性不育，其雌性器官仍具有正常的受精能力。只有花粉不育而雌蕊具有受粉能力的雄性不育導入到雜交樣本時，在人工雜交里不需要去雄(castration)，所以可利用在改良、種植雜交種子的雜交優勢育種法的F1選種(seed gathering)里。
細胞核內根據基因的雄性不育稱為“細胞核雄性不育(genic malesterility)”，這些主要在進行隱性遺傳并隱性同型結合(homozygouslyrecessive)時發生不育。由此，利用它生產F1雜交種子時只得到約50％的不育株，所以為了確認F1個體的育性，必須使各個體開花后確認花粉生成的過程。此外，雄性不育系的保持以及擴繁也需要很多努力，而且有些作物花太小而很難判斷育性，并對營養生長期太長的作物很難適用。
一方面，根據細胞質基因的雄性不育稱為“細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility，以下稱為“CMS”)”，這是由于細胞質的緣故線粒體不能執行正常的功能而生成非正常的花粉，因而不具備自花授粉能力。CMS是母體遺傳(maternal inheritance)，雜交任何可育系也不育株達100％，所以雄性不育系的保持很容易，非常方便地適用于以葉子、莖等營養器官為收獲物的作物里。
由于這些原因，目前正在繼續進行一些在生產雜交種子時試圖利用CMS的試驗，并且對許多植物體CMS的研究進行到了分子水平。從而澄清了許多引起CMS的細胞質因素。目前在十字花科(Cruciferae family)作物里具有CMS系的白菜屬(Brassica sp.)有Polima，Ogura，Napus，Anand等，蘿卜屬(Raphanus sp.)有Ogura，Kosena等。這些品系都是因為細胞質內的線粒體基因的結構變形或者生成新的開放閱讀框(ORF，open reading frame)的緣故引起CMS。(Cardi，T.and Earle，E.B.，Theor.Appl.Genet，94204-212，1997；Grelon，M.et al.，Mol.Gen.Genet，243(5)540-547，1994；Iwabuchi，M.etal，Plant Mol.Biol.，39(1)183-188，1999)。
到目前為止所知的CMS蘿卜系里Ogura-CMS系在雄性不育的導入率和穩定性方面最優秀。由此，生產蘿卜的F1雜交種子時主要使用Ogura-CMS系。但是，Ogura-CMS系的雄性不育不是完全根據細胞質因素引起的，也有細胞核內因素的影響。而且，Ogura-CMS系作為生產雜交種子的雜交親本時，按育種系CMS的導入與否出現顯著的差異。由于這些問題，利用Ogura-CMS系而生產F1雜交種子是有育限的。
因此，迫切的要求開發一種對F1雜交種子的雄性不育導入率高的新CMS蘿卜系。但是，和分離、鑒別微生物的過程有所不同，確認植物CMS特性的過程因為需要很多時間和努力，所以對此的開發并不活躍。
一方面，在植物的育種里為了選擇具有指定性狀的系，和性狀相關的特性作為標記。過去利用根據性狀特性(例花的顏色)變異的標記(Staub，J.E.et al.，HortScience，31(5)729-741，1996)，但是很多性狀的標記根據環境不僅有變化的可能(例黃瓜的新育形基因de)，而且存在標記的數量極有限的缺點。
由此，最近有開發研究利用在DNA堿基序列水平上發生的變異的分子標記(DNA標記)。性狀植物含有很多DNA標記，且對植物體的功能或生理不會有障礙，而使得利用標記成為一個很好的方法(Jones，N.et al.，NewPhytol.，137165-177，1997)。在蘿卜屬的CMS系中，已經開發對Ogura-CMS和Kosena-CMS系的DNA標記。利用擴大上述標記的引物，應用PCR對各系獨特的標記(PCR產物)的檢測而選擇各CMS系。由此，開發F1雜交種子的雄性不育導入率高的新CMS蘿卜系，同時開發用來選擇這些新品系的標記。
對此，本發明者開發新的CMS蘿卜系的過程中，分離、鑒別擁有與傳統的Ougra-以及Kosena-CMS蘿卜系不同基因型CMS的NWB-CMS蘿卜系，這種NWB-CMS蘿卜系的F1植物體的雄性不育導入率比利用在傳統生產F1雜交種子的Ougra-CMS蘿卜系更高，并一起開發了這種NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記。

發明內容
本發明的目的在于提供具有新基因型的細胞質雄性不育(CMS)特性的NWB-CMS蘿卜系(Raphanus sativus line)的胼胝體(保藏號KCTC10339BP)。
本發明的另一目的在于提供利用上述胼胝體制造NWB-CMS蘿卜系植物體的方法，以及上述NWB-CMS蘿卜系植物體與要導入雄性不育的雄性可育蘿卜系植物體雜交而生產NWB-CMS蘿卜系的雜交種子的方法。
本發明的又一個另外目的在于提供擴大NWB-CMS蘿卜系植物體選擇用DNA標記，以及上述DNA標記的引物。
本發明“NWB-CMS蘿卜系”是指在本發明分離、鑒別的蘿卜系，且和傳統CMS不同的具有新基因型CMS的蘿卜系。
本發明的NWB-CMS蘿卜系的胼胝體(保藏號KCTC 10339BP)，具有新基因型的細胞質雄性不育(CMS)特性，并且包含序列號5和序列號6以及序列號5或序列號6的堿基序列。
而且本發明，還進一步提供了將上述胼胝體誘導，利用組織培養而無性生殖NWB-CMS蘿卜系植物體的制造方法。
上述植物體的制造方法包括(a)從第一項的胼胝體誘導芽(shoot)的階段；(b)形成上述芽的胼胝體里誘導生根的階段；以及(c)形成上述生根的胼胝體經過土壤馴化和再分化過程形成植物體的階段。
并且本發明，還提供了上述NWB-CMS蘿卜系植物體與要導入雄性不育的雄性可育蘿卜系雜交為特點的CMS蘿卜系雜交種子的制造方法。
本發明還提供了具有以序列號碼5或者序列號碼6表示的堿基序列為特點的NWB-CMS蘿卜系植物體選擇用DNA標記，擴大上述標記的引物以及包括上述引物和PCR反應混合物為特點的NWB-CMS蘿卜系植物體的選擇試劑盒(kit)。
上述引物用序列號碼1和2，或者序列號碼3和4的引物成雙為特點。
本發明人為了開發具有新的基因型CMS的蘿卜系，把中國吉林省地區的野生青皮蘿卜約100多種作為對象選擇具有CMS特性的蘿卜。把野生青皮蘿卜作為雜交樣本和雄性可育個體進行雜交。把上述野生青皮蘿卜和雄性可育系雜交后生產的F1個體再和雄性可育系進行回交(backcross)后生產F2個體，然后調查生產的F2個體的花粉生成而實現CMS的確認。
這時在F2個體里雄性可育和雄性不育都出現的話，雜交樣本的雄性不育是被細胞核內基因和細胞質基因引起的，只出現雄性不育個體時則純粹是被細胞質基因引起的雄性不育。通過多次的檢查最終選擇確認為安全地擁有CMS特性的蘿卜。
其后，為了調查對已選蘿卜的F1個體的雄性不育導入率，把上述已選蘿卜作為雜交親本生產F1種子。其結果，和其他系雜交的上述蘿卜的雄性不育導入率比利用在傳統F1選種的Ougra-CMS蘿卜系明顯高(參照表1)。
然后，本發明者為了確認上述蘿卜是否為傳統的CMS蘿卜系，利用把對Ougra-以及Kosena-CMS蘿卜系獨特的DNA標記擴大的引物進行PCR。其結果，在本發明選擇的蘿卜里沒有檢測出Ougra-以及Kosena-CMS蘿卜系的獨特的DNA標記(參照圖1)。從而本發明里選擇的蘿卜確認為是和傳統的CMS蘿卜系不同的品系，并命名為“NWB-CMS”。
本發明的NWB-CMS蘿卜系的植物體用當前行業所共知的一般的組織培養方法可無性生殖。比如，容易進行白菜，蘿卜等的十字花科植物的組織培養的器官發生的微細增殖法(培養無形成器官的葉子，葉柄，莖節，子葉，子葉軸等的組織在上述組織的表面誘導新的芽眼的方法)，或者用通過誘導胼胝體的再分化方法等無性生殖。
具體地說，把本發明品系的種子在1/2MS培養基里平皿接種(plating)培養后，第四天除掉包含一些葉柄的子葉后把這些在MS培養基里分化并誘導胼胝體。然后，從上述胼胝體誘導芽(shoot)，形成芽的胼胝體移到根誘導培養基里后誘導生根。最后，經過土壤馴化和再分化過程成長為完全的植物體。2002年9月18日，本發明者把NWB-CMS蘿卜系的胼胝體(callus)寄存到韓國生命工學研究院(Korea Research Institute of Bioscience &BiotechnologyKRIBB)的基因銀行(保藏號KCTC 10339BP)。
根據本發明使上述NWB-CMS蘿卜系的植物體和導入雄性不育的植物體(雄性可育蘿卜系)雜交而生產F1種子。
本發明的雜交種子生產方法可適用于所有雄性可育系里，舉例子來說有漢城春1523，漢城春1978，總太1642，珍珠大平340，時無1462，圣護院52，總太1968，總太2015，1934(義城半青和總太的分離系統)，Mn002，Mn003，YB-1，1825(青皮核總太的分離系統)，AD 1002，Mn006，三季春1634，宮重總太JA046，宮重總太JA048，宮重總太JA049，宮重總太JA053，宮重總太1642，宮重總太1921，宮重總太1923，宮重總太1929，宮重1706，晚抽宮重2004，晚抽總太1916，晚抽總太1917，晚抽總太1918，美濃2113，漢城春1861，漢城春2064，圣護院1877，圣護院1947，龍峴1709，圓白分離Mn005，圓白分離1935，總太1946等。
一方面，通過圖1確認用傳統的Ougra-以及Kosena-CMS系選擇用DNA標記是不能選擇本發明的NWB-CMS蘿卜系，但是對上述Ougra-以及Kosena-CMS系獨特的標記是無法區分本發明的NWB-CMS蘿卜系和雄性可育系。由此，本發明人開發了對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記的基礎作業，在十字花科內存在的不同的CMS系之間RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)進行分析。
具體地說本發明對近緣種之間的細胞質區分很有用，并進行了提供豐富的統計資料的線粒體DNA的RFLP。在各系中抽出的總DNA用六個限制酶(BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII，XbaI)分別切斷并電泳后，進行Southern blot分析而比較RFLP式樣。
這時所用的探針是在十字花科植物之一的阿拉伯芥(Nrabidopsis thaliana)里所澄清的32個線粒體基因(參照表二)。通過RFLP的結果搜尋引起不同的座位(polymorphic site)，確認所用探針的32個基因里atp6以及atp9基因的3′部分發生變異(參照圖2以及圖3)。
而且，比較各基因的RFLP式樣(pattern)的結果是，nad3基因作為探針時，出現和atp6基因以及atp9基因作為探針的情況分別類似的條帶(band pattern)(參照圖4以及圖5)。從這些結果推定在線粒體基因組里atp6基因以及atp9基因位于和nad3基因鄰接的位置上。
本發明人參照上述RFLP分析結果，選擇對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記。為了這些，參照atp6基因以及nad3基因的堿基序列制造擴大atp6基因5′部分和nad3基因之間的正方向以及逆方向引物。上述引物分別命名為“ia6f”和“rn3f”，把這些的堿基序列用序列號碼1以及2記載。利用上述引物，NWB-CMS蘿卜系的DNA作為模板后進行PCR的結果是，只有NWB-CMS蘿卜系里檢測出約1.8kb大小的帶(band)(參照圖6的A)。
而且，參照atp9基因以及nad3基因的堿基序列制造擴大atp9基因的3′部分和nad3基因之間的正方向以及逆方向引物。上述引物分別命名為“ia9f”和“n31r”，把這些堿基序列用序列號碼3以及4記載。其后，利用上述引物進行PCR的結果，只在NWB-CMS蘿卜系里檢測出約2.3kb大小的帶(band)(參照圖6B)。
此外，本發明人分析了對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記的堿基序列。根據本發明的DNA標記之一的ia6f以及rn3f引物擴大的PCR產物的堿基序列記載為序列號碼5。根據本發明的DNA標記的另一個ia9f以及n31r引物擴大的PCR產物的堿基序列記載為序列號碼6。
本發明為了擴大序列號碼5或者序列號碼6的DNA標記而提供的標記引物包括當前行業可設計的所有引物。舉一例來說，具有在本發明制造的用序列號碼1以及2表示的堿基序列ia6f以及rn3f引物，然后用序列號碼3以及4表示的堿基序列ia9f以及n31r引物。
本發明的NWB-CMS蘿卜系選擇試劑盒里包括的PCR反應混合物可含有PCR反應里所需要的一般物質，比如說Taq聚合酶(polymerase)，反應緩沖溶液，dNTP混合物，MgCl2，BSA和適當量的水等。而且，根據本發明的試劑盒，另外可包含確認PCR產物的檢測與否的瓊脂糖(agarose)和電泳緩沖溶液。
在作物育種里，不僅需要很多努力和經費，而且利用迅速性、準確性以及敏感性高的PCR技術檢測DNA標記的話，目標性狀選擇將更準確。由此，利用本發明的引物(primer)進行PCR，并檢測上述引物擴大的本發明的DNA標記的有無，所以NWB-CMS蘿卜系選擇更迅速、準確。


圖1A是Ougra-CMS蘿卜系用特殊的引物行PCR結果的凝膠體照片。
圖1B是Kosena-CMS蘿卜系用特殊的引物進行PCR結果的凝膠體照片。
其中圖1A和圖1B的各泳道如下泳道1白光泳道2新珍珠 泳道3YR拓洋泳道4獻夏泳道5NWB1 泳道6NWB2泳道7MF1 泳道8MF2 泳道9蘿卜的葉泳道10白玉春 泳道11圓白泳道12春作泳道13太白 泳道14紅風1 泳道15紅風2圖2A是用EcoRI酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp6基因作為探針進行Southern blot的結果。
圖2B是用XbaI酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp6基因作為探針進行Southern blot的結果。
圖3A是用EcoRV酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp9基因作為探針進行Southern blot的結果。
圖3B是用HindIII酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp9基因作為探針進行Southern blot的結果。
圖4A是用EcoRI酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探針進行Southern blot結果的比較。
圖4B是用EcoRV酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探針進行Southern blot結果的比較。
其中圖4A和圖4B的各泳道如下泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光 泳道4新珍珠泳道5MF1泳道6MF2圖5A是用DraRI酶切各CMS蘿卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探針進行Southern blot結果的比較。
圖5B是用EcoRV酶切各CMS蘿卜系的DNA后，把atp6基因和nad3基因作探針進行Southern blot結果的比較。
其中圖5A和圖5B的各泳道如下泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光 泳道4新珍珠泳道5MF1泳道6MF2圖6A是根據本發明的ia6f以及rn3f的引物進行PCR的結果的凝膠體照片。
圖6B是根據本發明的ia9f以及n31r的引物進行PCR的結果的凝膠體照片。
其中圖6A和圖6B的各泳道如下M分子量標記泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光泳道4新珍珠 泳道5夏童泳道6YR拓洋泳道7獻夏 泳道8Huyumine泳道9蘿卜的葉泳道10白玉春泳道11春作 泳道12太白泳道13紅風1 泳道14紅風3 泳道15圓白泳道16MF1 泳道17MF2泳道18小松菜泳道19Donskya 泳道20Jasai 泳道21Anand
泳道22綠風3泳道23秋強圖7是根據本發明的ia6f以及rn3f引物(黑色用陰影的斜體表示)擴大的部位，包括引物序列的用灰色陰影表示的堿基序列(226-999以及2290-2645)分別表示atp6基因和nad3基因。
圖8是本發明的ia9f以及n31r引物(黑色用陰影的斜體表示)擴大的部位，包括引物序列的用灰色陰影表示的堿基序列(102-321以及2596-2640)分別表示和atp9基因以及nad3基因類似的部分。
具體實施例方式
以下，根據實例詳細地說明本發明。
但是，如下實例只是舉例本發明而已，本發明的內容并不僅限制在如下實施例里。
實施例1NWB-CMS蘿卜系的開發以及利用它進行雜交種子的生產本發明人為了開發具有新的基因型的CMS的蘿卜，把中國吉林省地區的野生青皮蘿卜100多種作為對象，調查花器組織的花粉發育以及自花授粉后一次性的選擇判定為擁有雄性不育特性的蘿卜20種。其后，已選蘿卜作為對象再一次進行第二次調查而最終選擇擁有CMS特性的一個蘿卜。這時把和雄性可育系進行雜交后生產的F1個體再一次和雄性可育系進行回交而生產F2，然后調查生產的F2個體的花粉生成而進行CMS的確認。
其后，本發明人為了確認選擇的CMS蘿卜系是否為F1的雜交親本，而與需要導入雄性不育的育種系進行雜交實驗。這時，要導入CMS的育種系使用如下表1里記載的16種類的育種系(韓國(株)NONGWOO BIO公司)，對照群是使用主要用在生產傳統雜種種子的Ougra-CMS蘿卜系。這時上述Ougra-CMS蘿卜系使用白光(韓國興農種子(seeds))，獻夏(日本sakada種子)以及Huyumine(日本sakada種子)。生產的F1種子里導入雄性不育是通過調查花器組織的花粉發育以及自花授粉程度來確認。在用Ougra-CMS蘿卜系的實驗(對照群)里，在一個Ougra-CMS蘿卜系(白光)里明確地確認CMS已導入時，其他Ougra-CMS系(獻夏以及Huyumine)沒有進行雜交實驗。
其結果，如下表1里記載的所示，把Ougra-CMS蘿卜系作為雜交樣本時，在16種類的育種系里只有約50％程度出現雄性不育，此外可確認Ougra-CMS蘿卜系的CMS導入與否按品系具有顯著的差異。
另一方面，在本發明選擇的CMS蘿卜系作為雜交親本時在16種類的所有育種系里出現雄性不育系。而且，和宮重總太JA046、宮重總太JA048、宮重總太JA049、宮重總太JA053、宮重總太1642、宮重總太1921、宮重總太1923、宮重總太1929(一般種，日本)，宮重1706(一般種，日本)，晚抽宮重2004(一般種，日本)，晚抽總太1916、晚抽總太1917、晚抽總太1918(一般種，日本)，美濃2113(一般種，日本)，漢城春1861、漢城春2064(農友BIO，韓國)，圣護院1877、圣護院1947(Sakada，日本)，龍峴1709(一般種，中國)，圓白分離Mn005、圓白分離1935(南京市蔬菜種子公司，中國)，以及總太1946(一般種，日本)的雜交實驗里雄性不育系統也達100％。
本發明選擇的CMS蘿卜系的雄性不育導入率比傳統的Ougra-CMS蘿卜系更優秀。而且，本發明選擇的CMS蘿卜系作為生產F1雜交種子的雜交親本更優秀。
表1按蘿卜系CMS導入與否的判別


*S不育性(sterile progenies)，F可育性(fertile progenies)Seg.不育性和可育性都出現(segregating progenies)N.T不進行雜交實驗實施例2本發明選擇的CMS蘿卜系的CMS基因型確認通過和其它品系雜交CMS導入的能力，通過實施例1確認在實施例1里選擇的CMS蘿卜系比傳統的Ougra-CMS蘿卜系更優秀。本發明人為了確認上述CMS蘿卜系是否和傳統的CMS蘿卜系同樣，或者是是否為新的CMS系，使用Ougra-以及Kosena-CMS蘿卜系的選擇用引物進行PCR。
2-1)使用Ougra-CMS蘿卜系作引物進行PCR。
首先，從本發明選擇的CMS蘿卜系里分離DNA后，把這些作為模板，利用具有以序列號碼7以及8表示的堿基序列的引物進行PCR。PCR使用韓國(株)BIONEER公司的PCR試劑盒(AccuPower Premix)而執行。
反應條件是在95℃里5分鐘進行前變性(pre-denaturation)后，在95℃里30秒；在55℃里30秒；以及在72℃里1分鐘的周期反復30回后，最終在72℃里10分鐘反應。這時作為對照群使用十種類的Ougra-CMS蘿卜系，無法確認基因型的CMS系(圓白)，還有2個種類的雄性可育系(MF1以及MF2)，對這些信息記載在表4里。其后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳。
其結果，如圖1A里所示，在現有的Ougra-CMS蘿卜系里檢測出540bp大小的帶(band)，但是根據本發明的CMS蘿卜系里沒有檢測出。而且，雄性可育系MF1和MF2以及沒有明確基因型的雄性不育系圓白里也沒有檢測出帶(band)。
2-2)使用Kosena-CMS蘿卜系作引物進行PCR使用具有以序列號碼9以及10表示的堿基序列的引物按照和上述參考例2-1)同樣的方法進行PCR。這時對照群使用和上述參考里2-1)同樣的蘿卜系。使用上述引物進行PCR時，報告為Kosena-CMS蘿卜系的情況是檢測出約250bp大小的帶(band)，Ougra-CMS蘿卜系的情況是檢測出約278bp大小的帶(band)(Yamagishi et al.，Theor Appl Genet.，93325-332，1996)。
其結果，如圖1B所示，在Ougra-CMS蘿卜系里檢測出約278bp大小的帶，而根據本發明的CMS蘿卜系和雄性可育系里沒有檢測出對Kosena-以及Ougra-CMS系獨特的帶。
從上述結果可確認本發明的CMS蘿卜系和傳統的Ougra-以及Kosena-CMS系是不同的品系，把這些命名為“NWB-CMS”。
實施例3NWB-CMS蘿卜系的胼胝體誘導以及再分化本發明的NWB-CMS系的種子在1/2MS培養基里平皿接種而培養后，第四天除掉包括一些葉柄的子葉，并把這些在MS培養基(包含玉米素(zeatin)5mg/L，NAA0.1mg/L)里分化后誘導胼胝體。胼胝體在芽誘導培養基里誘導芽后，形成芽的胼胝體轉移到根誘導培養基里一星期期間誘導生根。
其后，選擇誘導生根的植物體，洗凈沾在根里的培養基后，轉移到裝滿已殺菌土壤的花盆后種植。這時一星期里用塑料覆蓋花盆而使它慢慢適應環境，約一個星期以后拿掉塑料并完全再分化為植物體。2002年9月18日，本發明者把NWB-CMS蘿卜系的胼胝體寄存到韓國生命工學研究院基因銀行里(保藏號KCTC 10339BP)。
實施例4利用RFLP方法對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記通過上述實例1和2，本發明人確認NWB-CMS蘿卜系和傳統的CMS系完全不同，而且對Ougra-以及Kosena-CMS蘿卜系獨特的標記無法區分雄性可育系以及未明確CMS基因型的品系(圓白)和NWB-CMS系。由此，本發明人為了開發對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記而進行RFLP。
4-1)為RFLP的探針制造CMS是細胞質內的線粒體，它不能執行正常的功能且形成非正常的花粉使植物不具備自花授粉能力的現象。對此，本發明人使用在阿拉伯芥里已知的線粒體基因作為RFLP的探針而通過如下的實驗制造探針。
首先，參考如下表2里記載的32個阿拉伯芥的線粒體基因的堿基序列而制造引物，各引物的序列記載在如下表3里。32個基因的堿基序列和這些的基因信息是參考Unseld等的論文(Unseld，M.etal.Nature Genetics，1557-61，1997)以及Genbank的注冊號碼NC_001284。
其后，從NWB-CMS蘿卜系分離DNA后，把這些作為模板進行PCR。PCR是利用(株)BIONEER的PCR試劑盒(AccuPower Premix)而進行的。PCR在94℃里5分鐘進行前變性(pre-denaturation)后，在94℃里30秒；在55℃里30秒；以及在72℃里2分鐘把周期反復35回以后，在72℃里10分鐘最終擴展(extension)后終結反應。其后，把PCR產物通過凝膠洗脫(gel elution)分離。在32個基因如下表3的25號orf240基因是把NWB-CMS蘿卜系的DNA作為模板時PCR不能擴大，所以把阿拉伯芥的DNA作為模板進行PCR。
表2在RFLP分析中用探針使用的32個線粒體基因


表3對32個線粒體基因的引物的堿基序列


*F正方向引物，R逆方向引物4-2)RFLP分析作為開發對NWB-CMS蘿卜系獨特的DNA標記的基礎作業，分析十字花科內存在的不同的CMS系之間的RFLP。為了這些，使用包括NWB-CMS系的如下表4的1-8以及15-17號的雄性不育以及雄性可育系作為實驗對象。
從各品系中按照當前行業共知的DNA分離方法分離總DNA后，把它們分別用6個限制酶(BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII，XbaI)消化。消化的DNA在瓊脂糖凝膠里進行電泳后，將其移到尼龍薄膜里并進行Southernblot分析。這時所用的探針是上述實施例4-1)里得到的32個線粒體基因。如此進行RELP而比較對32個基因的RFLP式樣。
表4根據本發明的DNA標記選擇里利用的蘿卜和白菜系

其結果，作探針使用的32個基因里有19個基因沒有出現多形性(NWB-CMS蘿卜系里獨特的帶)(未圖示結果)。而剩下的13個基因里，除了atp6以及atp9基因的11個基因作為探針的情況是6個限制酶里只有2個以內的限制酶里出現了多形性，由此推定是根據單純的點突變而出現。
但是，把atp6基因作為探針使用時，6個限制酶中的5個限制酶BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV以及XbaI里出現了多形性，其中EcoRV以及XbaI的結果分別顯示在圖2A和圖2B里。
而且，把atp9基因作為探針時，在DraI，EcoRI，EcoRV以及HindIII的4個限制酶里出現了多形性，其中EcoRV以及HindIII的結果分別顯示在圖3A和圖3B里。因此atp6以及atp9基因時出現的多形性不是根據單純的點突變，而是根據線粒體基因組內的基因再組合，缺失或者插入而出現的。
一方面，各品系的DNA用EcoRI和EcoRV分別酶切后，atp6基因以及nad3基因用作探針并進行Southern blot分析時，在NWB-CMS蘿卜系里出現類似大小的帶(參照圖4A和圖4B)。從這些結果推定atp6基因和nad3基因在線粒體基因組里位于互相鄰接的位置上。
而且，各品系的DNA用DraII和EcoRV分別酶切后，atp9基因和nad3基因作為探針并進行Southern blot分析的結果是，DraI的情況是在所有品系里出現類似的帶形態(參照圖5A)，EcoRV的情況是在Ougra-CMS蘿卜系里出現類似大小的帶(圖5B)。從這些結果推定atp9基因和nad3基因也是在線粒體基因組里位于互相鄰接的位置上。
實施例5NWB-CMS蘿卜系選擇用引物的制備本發明者通過上述實例4確認atp6基因和atp9基因的ORF(open readingframe)里發生了變異。而且，nad3基因和atp6基因以及atp9基因分別顯示出類似的RFLP式樣時，推定nad3基因和atp6基因以及atp9基因在線粒體基因組里位于鄰接的位置上。由此，本發明人參考上述3個基因的堿基序列而制備擴大推定為發生變異部分的堿基序列。
首先，制備擴大的atp6基因的5′部分和nad3基因之間的正方向以及逆方向引物。制得的引物分別命名為“ia6f”和“rn3f”，其堿基序列用序列號碼1以及2記載。而且，制備擴大的atp9基因的5′部分和nad3基因之間的正方向以及逆方向引物。制作的引物分別命名為“ia9f”和“n31r”，其堿基序列用序列號碼3以及4記載。
實施例6利用本發明引物的白菜和作物的PCR分析本發明人為了確認上述實施例5里制得的引物是否擴大對NWB-CMS蘿卜系獨特的PCR產物而進行如下的實驗。所用的實驗材料是上述表4里記載的蘿卜和白菜的雄性可育以及雄性不育系。
6-1)使用ia6f以及rn3f引物的PCR首先，將在各品系里分離的DNA作為模板，利用具有用序列號碼1以及2記載的堿基序列的ia6f以及rn3f引物進行PCR。PCR是利用(株)BIONEER公司的PCR試劑盒(AccuPower Premix)而執行。反應條件是在95℃里5分鐘進行前變性后，在95℃里1分鐘；在55℃里1分鐘；以及在72℃里2分鐘的周期反復30回后，在72℃里10分鐘最終反應。其后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳。其結果，如圖6A所示，只在NWB-CMS蘿卜系里檢測出約1.8kb大小的獨特的帶。
6-2)使用ia9f以及n31r引物的PCR除了使用具有以序列號碼3以及4記載的堿基序列的ia9f以及n31r引物以外，按照和上述實例6-1)同樣方法進行PCR。其結果，如圖6B所示，只在NWB-CMS蘿卜系里檢測出約2.3kb大小的獨特的PCR產物。雖然在雄性可育系綠風3和秋強里也檢測出PCR產物，但是這些PCR產物與在NWB-CMS蘿卜系里出現的PCR產物大小不同，由此可確認在雄性可育系里擴大的PCR產物和在NWB-CMS蘿卜系里擴大的PCR產物不同。
實施例7根據本發明的引物擴大的PCR產物的序列分析委托(株)BIONEX公司分析在上述實施例6里得到的2個PCR產物的堿基序列。根據ia6f以及rn3f引物擴大的PCR產物的堿基序列的分析結果是，atp6基因和nad3基因相差大約1290bp距離程度。上述兩個引物擴大atp6基因和nad3基因間的距離(參照圖7)。根據ia6f以及rn3f引物擴大的PCR產物的整個堿基序列用序列號碼5記載。
而且，根據ia9f以及n31r引物擴大的PCR產物的整個堿基序列的分析結果是，上述兩個引物和本發明人預想的不同，沒有擴大atp9基因和nad3基因間的距離。只是，上述PCR產物的序列里包括n31r引物的堿基序列的附近存在和nad3基因類似的堿基序列(圖8的堿基序列中相應2596～2640的序列)(參照圖8)。根據ia9f以及n31r引物擴大的PCR產物的整個堿基序列用序列號碼6記載。
如以上所述，本發明具有提供新的基因型CMS蘿卜系的胼胝體，利用它進行物體和雜種種子的制造方法以及NWB-CMS蘿卜系的植物體選擇用DNA標記的效果。根據本發明的NWB-CMS蘿卜系的胼胝體對F1植物體的雄性不育導入率很高，所以在生產CMS系的雜交種子發面應用廣泛。此外，獨特的DNA標記而具有檢測容易的優點。
序列目錄<110>株式會社農牛BIO<120>一種蘿卜系胼胝體和用它培育植物體及雜交種子的方法<130>PI034733<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>ia6f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>1cgcttggact atgctatgta tgaatgag 28<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>rn3f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>2gacgattgga tttctctatg agtggaaaa29<210>3<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>ia9f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>3ctctaaccga agctattgca ttgtttg 27<210>4<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223>n31r primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>4gctagtttct ttgatcctac tcggtgttcc 30<210>5<211>1785<212>DNA<213>Raphanus sativus<400>5cgcttggact atgctatgta tgaatgagat tttctatttt ataggggctc ttggtccttt 60atttatagtt cttgcattaa ccggtctgga attaggtgta gctatattac aagcttatgt120ttttacgatc ttaatctgta tttacttgaa tgatgctata aatctccatt aaagttcttc180tttctttcat ttagatttat aattgaacaa aagcgaggga tgagagtagt gttatttaga240gcagttacac agcccctctc cttgcagtcg agttgctaaa gcacctctcc tttgctgttc300gagtaaacaa gaaatgctcg agttactaaa caacccctag ggggcccctc tctgataagg360aaaaaaacga aaaaatctca aatttatgaa aaatcgactc caatggctgt tacccctgct420cggtagtttg atcggtttcg ttttcagacg ttttctagaa tcagaaggaa gcgctattct480gaccactacg tgcgtttcat tcttcgcgct agtgagcttc tccttttgtt ttagtcactt540tcgtttgaaa ggaccactga gggggattct caatctcttc ttactctttt ccgctgggtt600cgtgggatct ttcatacgga ttgaagtcat ccacctactg ggtggtcagg ctttgcccct660cctgttggga ccttttgttt ggaaggccgt agtaggggaa gcacttcctt ctacgggccc720taacggggcg gagagctcct ccacgtggga ggaggatccg tttgaactgg acgttctcga780ggaatcattc tcggactccc cccggcaggg agtcccagac ggaagagagt gaaccctcgg840tcaatcgacg tagctcgagg caccccaaac ggaagagggt gaaccctcgg taaatcggcg900gggtcccagg aagctgggcc tgcgctccag ctaatccagt cccttccggg gggacgaagc960tgggccatct gtctcctatc cctacagaag ggatgaaatg attggggggg atagcgtgga1020ggcgatagaa cgccgccttc tggctcgatt tgcttatccc ttatactcgg acatccaatt1080agcccacatt caagccgaaa gactcttcga ggtcaaggta gagattgtga aggtaatggc1140tggccttgat ccaacggggg attggatggg gcggggagct cgggccctcg acaatccccg1200taccgccacg ggagagcact ccgtgaagca gttataccac ctgttaagtg ctctaaatga1260gcgcggtaaa gaggccccag aatttcagga actcaaaaat agagtgttcc tcaagaaagg1320cggccctggg ggggactcta tcgcataagt aagcaagcta cctttcggga tgggcttttg1380cttctttctt tatttttcga tatgccgctt cttcgccagc aaggagcgag aaaacaaagt1440gggctgtaat gatgtcagaa tttgcaccaa tttctatcta tttagtgatt agtctgctag1500tttctttgat cctactcggt gttccttttc catttgcttc caatagttct acctacccag1560aaaaattgtc ggcctacgaa tgtggtttcg atccttccgg tgatgccaga agtcgtttcg1620atatacgatt ttatcttgtt tcaattttat ttttaatccc tgatctggaa gtcacctttt1680tctttccttg ggcagtacct cccaacaaga ttgatctgtt tggattttgg tccatgatgg1740cctttttatt tattttgacg attggatttc tctatgagtg gaaaa1785<210>6<211>2379<212>DNA<213>Raphanus sativus<400>6ctctaaccga agctattgca ttgtttgccc caatgatggc ctttttgatc ttattcgtat 60tctgatcgaa gaaggaaggt ttcattcagt ctcataaagc aagcacctct ttcacataag 120aaagtggagg caggcttgga tacgatctaa aatgattcca catgaaagag gaccgggcaa 180tcgccctctt gagtaatggg aagcgggcta gtccccgaaa atgcccgtta atcaagcaag 240ttggggaaca aaatcttcct tgttagttac tcatttcttc ggtcgagcgt tctccggacg 300tcgagaaatc tatcactcaa tcgctggccg ctctgtcatt gtctgatttt aggtttctga 360tcacactcga aattatgtat ctacttatcg tatttttacc cctgctcggt agttccgtag 420caggtttttt cggacgtttt ctaggatcag aaggaagcgc tattctgacc actacgtgcg 480tttcattctt cgcactggtg ggcttcctat ttggatttca catttcttcc tttcgtttga 540aaggaccact gagggggatt ctcaatctct tcttgctctt tttcatcgcc gtagtaatat 600ctttgatacg gatcaaagtc atccacctac tgggtggtca ggctttgccc ctgttggagc 660ccattatatg ggctgcagta ggagggggag cacttccttc tacgggccct aacggggcgg 720agagggacgc catgtgggag gaggatgact ttgaactttg agttctcgag gaatcattct 780cggactcccc cccggcaggg agtcccagac ggcagagggt gaacctcggt caatcagctt 840cctccccagg aagctgggcc atctgtcccc tatcaggacc agggcctacc tactgatagg 900aatggtaacc cgatggatct taatgctcgg ccctccctct cgtcgttgta caacgaaata 960gagagttccg actctttacg agcgcggaat ctccaattgg gggaggatct ggagcgaatc1020catgaaatgg aacggaacct ccagaacgag agggatcccg accgtcgtcg ggaagtagcc1080gcgcgcatag atcgggaggt gcgcgagctg gagcgacaaa tttcctctgt caaacccggg1140atgcagttcg ggatgatcaa ctggacgtat ggagggaggg gctttatgag gaattagcaa1200cgcaagggga gaaacaggcc cgccttacgt tactaaattc gtggctcaag gtgatcatcc1260atacacggaa tcaccaaccc cccaaaaact aaagctttcg ttctcttctt ttttttttac1320ttgattggca ggtgtacaac aaccttaacc gcgcaagcct gggctgggcc tacctccatc1380cttagaggag ccgtatgagg cggaagcccc acgtacggtt ttgaagccga gcctttccag1440caatggggct tagggaccga tatgatgatt ggtttaggta gggcggccgg cctactacgg1500gcacccgcct gtagggatta gtgcgtgaga ccgcgatcca caaactgacg catgggactc1560accctttact tgagaataaa gaggggaaag atagcatgtc ccaagagcga ggcgagtttt1620ggaaccctac agcgagaggg acgcctcgcg agccgggctt ccagagatga ggccttttgg1680cgaagccaag tttctttcgg gccaccaaac cctgcaactg atgagaaaga aggccctatg1740gggtaaaggg aaaagcgtgt acgttgtcac actccctgcc ttccaaaggt gcctagagga1800cgggccagac gcagcagagc gacaacccgg gagcagattc cccaccggca gggggacagg1860agacggccat ctcaaggcac atcacgacct acaggtaaga ccggcgagac cagggaaggc1920aacccgattg ggagtcagag gatccatagt acctgcagcc ccacggactt aatattcctc1980attttagaaa gcggagggaa gggatctctt ttctgcaacg gaaaaaaaaa cggagcagat2040ttgactcggc acaacctaac gatacattca ataccaatga tctgtgccta gaatgcgttg2100ctagatctct gttctaaaaa gctatacagg caacaagaaa gttgaccggg ggcgggtctt2160ccctttcatt acttatttca cgacgaggga accgcgcccg catcagtcga agtggtgccc2220tcctctaaga aagaaggttt cagtctcatt caaccaactc tctttttgaa gcagatagtt2280cacgagataa ttgagtaagt taagatagat gtcacaattt gaaccaaagg cctttttagt2340gattagtctg ctagtttctt tgatcctact cggtgttcc 2379<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>5’primer for PCR of DNA marker specific to Ogura-CMS<400>7gaactgcgag tcaatccacg 20<210>8<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>3’primer for PCR of DNA marker specific to Ogura-CMS<400>8gatggatttg tgaatgagaa at 22<210>9<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>5’primer for PCR of DNA marker specific to Kosena-CMS<400>9gacatctaga gaagttaaaa at 22<210>10<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>3’primer for PCR of DNA marker specific to Kosena-CMS<400>10agcaattggg ttcacaaagc at
權利要求
1.一種NWB-CMS蘿卜系的胼胝體，于2002年9月18日保藏于韓國KCTC，保藏號為KCTC 10339BP，它具有細胞質雄性不育特性，并且包含序列號5和序列號6以及序列號5或序列號6的堿基序列。
2.一種以權利要求1所述的胼胝體進行組織培養而無性生殖的NWB-CMS蘿卜系植物體的培育方法。
3.根據權利要求2所述的NWB-CMS蘿卜系植物體的培育方法，包括如下幾個步驟(a)從第一項的胼胝體誘導芽的階段；(b)在形成上述芽的胼胝體里誘導生根的階段；以及(c)形成上述生根的胼胝體經過土壤馴化和再分化過程后形成植物體的階段。
4.一種CMS蘿卜系雜交種子的生產方法，其特征在于，將權利要求2或3制得的NWB-CMS蘿卜系植物體和要導入雄性不育的雄性可育蘿卜系植物體雜交。
5.根據權利要求4所述的CMS蘿卜系雜交種子的生產方法，其特征在于，所述的雄性可育蘿卜系選自漢城春1523，漢城春1978，總太1642，晉州大坪340，時無1462，圣護院52，總太1968，總太2015，1934，Mn002，Mn003，YB-1，1825，AD 1002，Mn006，三季春1634，宮重總太JA046，宮重總太JA048，宮重總太JA049，宮重總太JA053，宮重總太1642，宮重總太1921，宮重總太1923，宮重總太1929，宮重1706，晚抽宮重2004，晚抽總太1916，晚抽總太1917，晚抽總太1918，美濃2113，漢城春1861，漢城春2064，圣護院1877，圣護院1947，龍峴1709，圓白分離Mn005，圓白分離1935以及總太1946組成的群組。
6.一種NWB-CMS蘿卜系植物體的選擇用DNA標記，具有用序列號碼5或者序列號碼6表示的堿基序列。
7.一種擴大權利要求6的DNA標記的引物。
8.根據權利要求7所述的引物，其特征在于，所述的引物為在序列號碼1至序列號碼4里用任意一個表示的堿基序列為特點的引物。
9.一種NWB-CMS蘿卜系植物體的選擇試劑盒，包括權利要求7或8的引物和PCR反應混合物。
全文摘要
本發明涉及一種NWB－CMS蘿卜系的胼胝體，它具有新的基因型細胞質雄性不育(CMS)特性，并且包含序列號5和序列號6以及序列號5或序列號6的堿基序列。本發明還涉及將上述胼胝體誘導，利用組織培養而無性生殖的NWB－CMS蘿卜系植物體的制造方法，以及使用上述植物體和導入雄性不育植物體雜交為特點的有關雜種種子的制造方法。
文檔編號A01H1/02GK1488243SQ0315555
公開日2004年4月14日 申請日期2003年8月28日 優先權日2002年10月10日
發明者閔炳桓, 南奭鉉, 李熙正, 李時雨, 梁承均 申請人:株式會社農牛Bio