專利名稱：野菱優質工程苗快繁方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速繁殖野菱優質工程苗的方法。
背景技術：
野菱(Trapa incisa)是屬于菱科菱屬的一年生浮葉水生草本植物。它喜溫、喜水和充足的陽光，生長期較長。底部松軟肥沃，腐殖質含量高，淤泥沉積厚的河塘、溝渠、湖泊都適宜種養。該物種對水體污染有著較高的耐受性，在水生生態系統修復與重建工程中，可用于凈化水質；該物種還含有較多的營養成分，可做果、蔬、糧食用；并且具有較高的藥用價值。
野菱已經被列為國家二級重點保護野生植物，對野菱種質資源的保護已日益迫切。一方面，野菱種子在自然條件下的萌發率比較低，另一方面，水體的強度污染，也導致野菱的自然分布日益稀少。當前，市場上對野菱種苗的需求量很大，在試驗和生態工程中都有應用，但種源大多來自自然環境，大量打撈容易導致原產地生境的破壞；雖然可用野菱種子種植來彌補，但種植不僅需要合適的水生環境和較長時間，而且還受本身種子萌發率低的限制。另外，自然生境的野菱常帶有各種雜藻雜菌，容易造成移植生境的污染和有關生理生態試驗的誤差。
迄今國內外未見有關野菱無菌苗的人工擴繁培養的研究與報道。本方法是利用野菱的胚芽，采用不同的消毒方法和培養基質，產生無菌苗，并且從無菌苗進行快速擴繁。

發明內容
本發明的目的是利用植物組織培養方法，獲得并在室內大規模繁殖野菱優質工程苗，應用于國家重點保護野生植物的種質資源保護工作，并克服該物種野外收集有限且污染嚴重的弊端，適應我國淡水湖泊植被恢復、生態工程育苗以及野菱生理生態研究的需要。
本發明的技術方案是1.野菱無菌幼苗的獲得從野外自然生境中采集野菱的果實，置于2℃-4℃中冷藏一周，打破休眠。隨后，取出其中的胚芽，于肥皂水中浸泡2h，用自來水沖洗干凈并在流水下浸泡過夜。在超凈工作室中，用75％酒精浸泡20s，用無菌水漂洗后再放入AgNO3中浸泡7-10min，用無菌水徹底漂洗后接種于培養液①，見表1，并置于組織培養室中培養。室內平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃。期間注意觀察，隨時剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.野菱出芽誘導由上述步驟獲得的有明顯的根系的無菌幼苗，于超凈工作室中，轉接到培養基②中。2周以后，植株開始長壯，并在莖節處萌發新芽。待植株長到1cm，將其轉入培養基③，刺激植株更多的萌發新芽，重復上述方法，以獲得足夠多的無菌幼苗。上述擴增培養過程仍在組培室中進行，光照和溫度不變。
表1.野菱培養液①、②、③配方

*上述培養液按濃度配好后均用稀HCl或NaOH調整pH到5.8，分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于120℃、0.1MPa左右濕熱滅菌20min。
3.野菱工程苗的壯苗將上述培養基中約5cm的野菱無菌苗取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的培養缸中。保持水深20cm，每周換水并添加10％的Hoagland營養液以促進其生長。當室外白晝氣溫20℃以上時，將培養缸置于室外，直接利用太陽光照；否則，將培養缸置于溫室中，晝夜溫度分別保持18℃和25℃，并在白天適當補充人工光照至2500lx。上述培養保持到植株長至20cm以上。
4.野菱工程苗的應用(1)通過上述步驟2培養后，收獲根系發達、植株長于20cm的健康野菱小苗，取出洗凈，直接應用于試驗，避免雜菌雜藻的影響。
(2)通過上述步驟3培養后，獲得的株高30cm以上、根系發達的健康野菱植株；收獲時盡量保持其根系的完整，投放到水生植被恢復重建的工程區，并根據實地的退化程度，決定其栽種量和栽種密度，并可采用單一物種移植或者和其他物種混合移植。
本發明的效果在于
1)獲得了野菱的無菌苗。野外采集的野菱原材料本身污染嚴重，而本方法先用較溫和的肥皂水洗滌浸泡，然后在流水下沖洗以初步降低污染，然后通過75％酒精和AgNO3徹底滅菌，在培養液①中培養。該滅菌方法可以保證無菌率達80％，存活率達60％以上。
2)建立了野菱工程苗快速繁殖途徑。經過一段時間的馴化培養，野菱每2w在培養基②和③的培養條件下的芽增殖率達1∶3以上(即每個單株苗經2w的培養，至少可以獲得3株苗)。而每個新生的小苗，可以繼續進行以上的芽增殖操作。技術簡單，操作方便，而且所用的試劑均為常規化工產品，成本低廉，有利于大規模的工廠化生產。而且本方法主要利用的是野菱的營養繁殖，避免了遺傳變異的可能性。
3)本項發明可不分季節，隨時為湖泊植被恢復和利用野菱進行的生理生態實驗，提供足夠的優質工程苗，在湖泊水生生態系統恢復和重建工程中發揮重要作用。
具體實施例方式
實例1于2004年12月從南京溧水采得野菱種源，剖取其胚芽30個，用肥皂水浸泡2h，再用自來水洗凈，流水下沖洗過夜。在超凈工作臺中，用75％酒精和AgNO3經過一定時間的徹底滅菌，用無菌水洗凈，接種于培養液①中。于組培室中培養，平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度25℃。2周內除去剔除的染菌及死亡材料4芽，其余26芽均能生長。健康的幼苗轉接到培養基②，繼續在組培室中培養，野菱開始長壯，出現芽增殖。再轉入培養基③，野菱的芽大量增殖，長出新個體。以后每隔20d將單株野菱轉接進行芽增殖。60d獲得幼苗6300余株。
實例2將上述的培養材料洗凈移栽到鋪有滅過菌的沙石的培養缸中，并在溫室中培養。每周換水且補充Hoagland營養液以壯苗。20d內獲得健康工程苗6000余株，該批材料被應用于太湖富營養化水體生態修復工程中。
權利要求
1.一種野菱無菌苗培養及其工程苗快速擴繁的方法，其特征為該方法由以下步驟組成(1)從野外自然生境中采集野菱的果實，置于2℃-4℃中冷藏一周，打破休眠；隨后，取出其中的胚芽，于肥皂水中浸泡2h，用自來水沖洗干凈并在流水下浸泡過夜；在超凈工作室中，用75％酒精浸泡20s，用無菌水漂洗后再放入AgNO3中浸泡7-10min，用無菌水徹底漂洗后，接種于含有0.50mg/LIAA的1/2×Ms基本元素的培養液，并置于組織培養室中培養；室內平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃，獲得野菱無菌苗；(2)將無菌苗接種于含有2.00mg/L 6-BA和0.10mg/L NAA的1/2×Ms基本元素的培養液，促使植株長壯、發芽；待幼苗高1cm時，再轉入含有0.10mg/L6-BA和2.00mg/L NAA的1×Ms基本元素的培養液中，以誘導萌發更多新芽，并每隔20d將新生無菌苗重復步驟(2)，直至獲得足夠多的材料；(3)將上述培養步驟(2)中約5cm的野菱無菌苗取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的培養缸中，保持水深20cm，每周換水并添加10％的Hoagland營養液以促進其生長，直到植株長至20cm以上。
2.根據權利要求1方法擴繁的野菱工程苗在淺水湖泊濕地生態修復和生理生態試驗中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域。運用組織培養方法，通過擴繁獲得大量的野菱優質工程苗，以克服在水生植被恢復工程中大量移植野菱對原產地產生不良影響，以及自然環境中野菱種源稀缺并且污染嚴重的問題。野菱作為國家重點保護野生植物，其本身具有藥用價值，在湖泊水生生態系統恢復和重建工程中也有著重要的作用。針對目前水生生態系統退化嚴重的現狀，本方法的出現有著重要的意義。
文檔編號A01G7/00GK1692699SQ20051004037
公開日2005年11月9日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者安樹青, 蔡穎, 關保華, 王秉萱 申請人:南京大學