專利名稱：一種新型真菌殺蟲劑的生產和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌殺蟲劑，尤其涉及一種昆蟲病原真菌萊氏野村菌的生產和用途。
背景技術：
當前，農產品質量安全已成為社會關注的焦點，引起了我國各級政府的重視。推廣應用生物農藥，取代化學農藥尤其是高毒高殘留化學殺蟲劑，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。
全球應用的生物源農藥品種約30種，其中細菌性殺蟲劑蘇云金桿菌(Bt)是研究最多、產量最大、應用范圍最廣、最具代表性的生物殺蟲劑。目前以Bt為代表的生物農藥在生產實踐中仍存在四個問題需要研究解決①Bt菌株對防治害蟲的選擇性難以滿足實際生產中對多種害蟲并發危害一藥多治的需要，暴露出生物農藥殺蟲譜窄、特別是對夜蛾科害蟲難以控制的弱點。②對害蟲的作用方式主要是胃毒作用，致病機理單一是Bt生物農藥的防治效果差、作用速度慢的主要原因。③Bt類生物農藥持效期短和對爆發性害蟲控制作用弱，在害蟲種群中不能形成疾病自然流行，難以發揮自然控制作用。④缺乏對生物農藥使用技術系統的研究和合理科學使用，尚未建立生物農藥田間高效應用技術體系，制約了生物農藥的推廣。
病原真菌是又一類重要微生物農藥資源，大約有100個屬的真菌對鞘翅目、鱗翅目、雙翅目等昆蟲有致病性，具有胃毒、觸殺及疾病流行等多種作用途徑，近10年來歐美國家在真菌殺蟲劑研制方面發展迅猛，國外已有20多個產品注冊登記。萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是1903年自甘藍野螟幼蟲中分離獲得的重要昆蟲病原真菌，能寄生30多種鱗翅目、雙翅目害蟲，對夜蛾科害蟲的致病力更強，特別是能引起疾病流行(Mohamed，1977)，因而受到各國重視。美國應用該菌作為微生物殺蟲劑，誘發流行病及生態系統調節等途徑，防治大豆夜蛾類害蟲效果顯著(Ignoffo，1981；Boucias，1982)。日本學者研究發現，該菌廣泛分布于水田，適合防治雜食性的斜紋夜蛾等害蟲(淺山，1980)，也有報道對蚊幼蟲有較好防效。我國對真菌制劑的研究、開發已有20多年的歷史，其中以白僵菌、綠僵菌為主，應用白僵菌防治松毛蟲和玉米螟等害蟲的面積達667萬ha以上。但我國迄今尚無真菌殺蟲劑正式登記投產。蟲生真菌研究應用的滯后主要存在以下幾方面原因第一，在基礎研究方面長期忽視昆蟲病理學和流行學的基礎研究和工廠化生產發酵工藝的研究。第二，在應用方面未能研究生物學穩定的劑型及其相應的配套應用技術，生產條件簡陋，使用效果不穩定。第三，在菌種的選擇上比較單一，長期在立項上將大量投入集中在Bt、白僵菌上，其它優勢菌種未受到應有的重視。

發明內容
本發明的目的是為了從源頭上解決農產品農藥殘留超標的問題，實現農產品的優質、安全生產，保障人民身體健康和農產品出口創匯，開展真菌、病毒等新型生物源農藥的研究和開發，建立廣譜、高效、昆蟲疾病流行的生物防治平臺，以攻克微生物農藥殺蟲譜窄、作用速度慢、防效不穩定的弱點和微生物農藥高效施用技術研究滯后等重大關鍵問題為重點任務，提供一種新型真菌殺蟲劑的生產和用途。
本發明的目的是這樣實現的，新型真菌殺蟲劑的生產，是利用野外分離、實驗室純化的萊氏野村菌(菌株Nr04-3)，采用液固雙相發酵技術在含氮培養基上，控制溫度為25-34℃，PH值為5-8，連續黑暗的條件下液體培養60-80小時，固體培養7-10天，生產其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克(2×1010spore/g)的固態可濕性粉劑。
所述的控制溫度最佳為30℃。PH值最佳為6。液體培養最佳時間為72小時。所述的含氮培養基為豆餅瓊脂培養基，在豆餅瓊脂培養基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。
新型真菌殺蟲劑的用途，是使用新型真菌殺蟲劑防治、毒殺鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓時，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋后，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲生處。所述的鱗翅目害蟲包括斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟。新型真菌殺蟲劑用水稀釋配成的濃度為0.1～2％。
本發明通過分離野外的萊氏野村菌，采用固液雙相發酵技術，生產出先進水平的新型昆蟲病害流行真菌生物農藥，提高生物農藥對夜蛾科等頑固害蟲的效果，有效克制重大病蟲害的爆發危害，克服制約微生物殺蟲劑應用的瓶頸，加快微生物農藥的實用化進程，降低化學農藥在優質農產品中的殘留量和對農田生態環境的污染，實現農作物重大病蟲害可持續控制。該殺蟲劑對斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟等鱗翅目害蟲具有較好的防治效果，同時對蚊幼蟲孑孓也具有毒殺作用，可以廣泛應用于糧食、蔬菜、茶葉、森林及衛生等多種害蟲防治。
具體實施例方式
新型真菌殺蟲劑的生產，通過分離揚州野外的萊氏野村菌(菌株Nr04-3)，經實驗室純化，采用液固雙相發酵技術在豆餅瓊脂培養基上，控制溫度為30℃，PH值為6，連續黑暗的條件下液體培養72小時，固體培養7-10天。在豆餅瓊脂培養基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。生產其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克(2×1010spore/g)的固態可濕性粉劑。
新型真菌殺蟲劑用于新型真菌殺蟲劑防治、毒殺斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟等鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓。使用時，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋配成的濃度為0.1～2％，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲身處。
實施例1萊氏野村菌菌株培養特性1、溫度對菌株生長的影響萊氏野村菌各個菌株在14～34℃之間均能生長，26～30℃之間生長最快，接菌后2天，可見分生孢子。最適溫度為30℃；14℃以下，34℃以上生長明顯趨緩。該菌產孢量也以30℃最高(見表1)。6種菌株生長速度和產孢量不一致，接種后培養10天，Nr04-3的產孢量顯著高于其他菌株。
表1溫度對菌株產孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
2、pH對菌株生長的影響萊氏野村菌在pH值2～9范圍內，菌株均能生長，低于3或高于8時生長緩慢，最適為pH＝5～7，pH＝6時生長最好，產孢量也以pH＝6時最高。各菌株的產孢量差異顯著，Nr04-3產孢量最多(表2)。
表2pH對菌株產孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
3、光照對菌株生長的影響萊氏野村菌菌株在黑暗、日光燈、黑暗與散光交替及自然光照下均可生長。但在連續黑暗條件下生長最快，自然光照下生長最差。菌株產孢量也以黑暗條件下產孢最多，自然光照條件下產孢最少。(見表3)。
表3光照對菌株產孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
實施例2培養基篩選試驗1、不同培養基對菌株產孢性狀的影響同一種菌株在PDA、有機氮和SDAY三種培養基上形態變化不大。而用有機氮培養基和SDAY培養基更易獲得大量的分生孢子。有機氮培養基和SDAY上萊氏野村菌出現孢子，比用PDA培養的一般提前1天產孢，產孢量比PDA平板上大，與PDA的比值，有機氮培養基為1.17～8.75，SDAY的比值為1.09～10。菌株固體培養生產孢子的收獲適期為7～10天。
表5不同菌株在固體培養基上的產孢性狀

2、液體培養基對菌株產孢的影響用Nr04-3菌株進行液體培養產孢考察，在培養到48小時時，培養基C上的孢子濃度達109個/ml，顯著高于其他培養基產孢量；在培養72小時時，培養基A、B的產孢量也達109個/ml。84小時后，產孢量逐漸減少。考慮到能源等成本因素，一般推薦培養時間為72小時。
表6液體培養不同時間的產孢量

實施例3害蟲防治試驗1、昆蟲感病癥狀表現斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲受萊氏野村菌感染后，一般3天左右食欲減退，行動開始遲緩，4～5天后開始死亡，死亡高峰期在處理后的第6～8天，死亡時蟲體顏色不發生明顯變化。死蟲26℃保濕培養1天后蟲體長出少量白色菌絲，2～3天后菌絲由疏松逐漸變密覆蓋蟲體，蟲體僵硬。隨后蟲體被綠色孢子粉覆蓋，4天后形成密集的淡綠色小堆。
2、侵染途徑以相同濃度孢子懸浮液感染甜菜夜蛾，無論體表接觸還是經口感染，對甜菜夜蛾幼蟲均有較高活性。接種后3天，體表接觸處理的幼蟲死亡率為36.8％，死亡高峰為4～6天，最終死亡率為100％。經口感染的幼蟲對菌株的反應慢，死亡高峰為5～7天，最終死亡率為92％。
表7不同侵染途徑對甜菜夜蛾的效果

3、對不同昆蟲的毒力3-2感染濃度與死亡率的關系不同濃度孢子懸浮液感染各種幼蟲后，幼蟲死亡率與感染濃度關系的毒力回歸方程見表9。在一定濃度范圍內， 死亡率與感染濃度呈正比。參試昆蟲中二化螟、淡色庫蚊的致死中濃度最低，為1.10×106～7.0×106個孢子/ml，說明該菌株對這兩種昆蟲具有較高的生物活性。其次為甜菜夜蛾、斜紋夜蛾，致死中濃度為1.02×107～2.0×107個孢子/ml。茶尺蠖的致死中濃度較高，說明萊氏野村菌對茶尺蠖活性低。高濃度孢子懸浮液(5.40×109)對黃楊絹野螟有一定的活性，防效為55％，對小菜蛾無防效。
表9Nr04-3菌株對昆蟲幼蟲的致死中濃度(LC50)

權利要求
1.一種新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是利用野外分離、實驗室純化的萊氏野村菌，采用液固雙相發酵技術在含氮培養基上，控制溫度為25-34℃，PH值為5-8，連續黑暗的條件下液體培養60-80小時，固體培養7-10天，生產其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克的固態可濕性粉劑。
2.根據權利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是所述的控制溫度最佳為30℃。
3.根據權利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是所述的PH值最佳為6。
4.根據權利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是所述的液體培養最佳時間為72小時。
5.根據權利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是所述的含氮培養基為豆餅瓊脂培養基，在豆餅瓊脂培養基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。
6.根據權利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產，其特征是所述的萊氏野村菌為菌株NrO4-3。
7.一種新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是使用新型真菌殺蟲劑防治、毒殺鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓時，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋后，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲生處。
8.根據權利要求3所述的新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是所述的鱗翅目害蟲包括斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟和衛生害蟲孑孓。
9.根據權利要求3所述的新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是所述的新型真菌殺蟲劑用水稀釋配成的濃度為0.1-2％。
全文摘要
本發明涉及一種通過工業發酵技術繁殖生產萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)加工生產孢子粉的殺蟲劑。生產用真菌菌種為野外分離、實驗室純化的萊氏野村菌(菌株Nr04－3)，在專用培養基上，通過液固雙相發酵技術生產孢子粉殺蟲劑，殺蟲劑含量和劑型為2×10
文檔編號A01N63/04GK1718004SQ200510040999
公開日2006年1月11日 申請日期2005年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者徐健, 劉琴, 殷向東 申請人:江蘇里下河地區農業科學研究所