專利名稱：一種真菌孢子可濕性粉劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌殺蟲劑，具體地說涉及含殺蟲真菌孢子的可濕性粉劑。
背景技術：
由于化學農藥的長期大量使用所造成的對環境和人類自身的危害日益突出，各國政府紛紛出臺了限制或禁止使用化學農藥的政策。生物農藥由于具有高效、與環境友好和無污染等優點，因而是化學農藥比較理想的替代產品。在自然界中昆蟲病原微生物資源非常豐富，它是控制昆蟲種群數量最重要的生物因子。在微生物導致的昆蟲死亡中，病原真菌占60％以上。因此，研制和開發微生物殺蟲劑特別是真菌殺蟲劑受到國內外的廣泛關注。
可濕性粉劑是一種最基本的農藥劑型，可制成懸濁液，進行噴霧。它是用農藥原粉加入一定量的潤濕劑和填充料，通過機械碾磨、過篩制成。其規格要求99.5％的粉粒通過200號篩目，即粉粒直徑應在7.4×10-5m以下。
中國專利CN02156519.8公開了一種真菌孢子可濕性粉劑。所述可濕性粉劑由烏洛托品0.3％-1.0％、木質素5％-15％、尿素0.3％-1.0％、碳酸鈣3.0％-10％、拉開粉0.4％-0.8％和真菌孢子粉組成。所述粉劑能夠在生產、儲存、應用中保證孢子的生物活性和防治效果。但在該專利申請中并未提及所述粉劑的貯存期。
可濕性粉劑由于在加工、運輸、貯藏、使用方便等諸多優點，因此在農藥劑型中一直占有很大比例。但殺蟲真菌可濕性粉劑研究方面進展緩慢。主要原因在于殺蟲真菌的有效成分是活體的真菌繁殖體孢子或營養體菌絲，在貯存過程中容易失去活力。因此在制劑加工中，不僅要提高其使用的便利性，更重要的是如何通過制劑保持孢子或菌絲的活力，延長產品的貨架壽命。近年來，盡管國外已經有相應的產品注冊，但產品的貨架壽命仍不理想，國內外已報道的殺蟲真菌可濕性粉劑在低溫下的貯存期不超過12個月。
我國雖然在上個世紀90年代就進行過球孢白僵菌可濕性粉劑的研究，但也因貯存穩定性的問題，一直沒有見到其產品登記注冊。因此，研制生物學穩定的真菌殺蟲劑制劑，延長其貯存穩定性和貨架壽命，滿足商品化生產的要求，是促進真菌殺蟲劑產品產業化的瓶頸。

發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明人通過篩選與殺蟲真菌生物學相容的助劑，即制劑中使用的載體、濕潤劑、分散劑、穩定保護劑和紫外線吸收劑，優化制劑配方，最終研制出能夠顯著延長貯藏期和貨架壽命的真菌孢子可濕性粉劑。
因此，本發明的目的在于提供一種真菌孢子可濕性粉劑，其生物穩定性較佳、貯存穩定性好、且含孢量較高。
根據本發明的一個目的，本發明提供一種生物學穩定的真菌孢子可濕性粉劑，其由殺蟲真菌孢子粉和助劑組成，所述殺蟲真菌孢子粉在可濕性粉劑中的重量百分比為50～75％；所述助劑包括載體、濕潤分散劑和穩定保護劑；所述載體為白炭黑；所述濕潤分散劑為選自月桂氮卓酮、脂肪醇與環氧乙烷縮合物、固體萘磺酸鹽甲醛縮合物、甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物的一種或多種；所述穩定保護劑為選自羧甲基纖維素、變性淀粉、甲基纖維素、β-環糊精的一種或多種。
進一步的，在整個制劑中，載體的含量為10～15％重量，濕潤分散劑的含量為5～20％重量、穩定保護劑的含量為3～15％重量。
所述載體可以為選自本領域常規的較穩定且惰性的生物農藥載體，如白炭黑、高嶺土、硅藻土以及腐植酸等。
在本發明中，所述載體優選為白炭黑，其可與本發明所用的真菌孢子生物相容。
本發明中所用的殺蟲真菌孢子粉可以為任何可殺滅有害昆蟲的真菌的孢子粉。
所述真菌通常可為絲孢類昆蟲病原真菌。
更優選的，所述殺蟲真菌孢子粉為選自白僵菌(Beauveria)、綠僵菌(Metarhizium)、擬青霉(Paecilomyces)、輪枝菌(Verticillium)、野村菌(Nomuraea)和被毛孢(Hirsutella)等的一種或多種絲孢類真菌的孢子粉。
最優選的，所述殺蟲真菌孢子粉為白僵菌孢子粉。
在本發明的一個具體實施方式
中，所用的孢子粉為球孢白僵菌孢子粉，然而本領域技術人員可以理解，上述種類的殺蟲真菌具有相似的生物學性質，因此，本發明的可濕性粉劑的配方也適用于其它種類的殺蟲真菌孢子。
本發明更優選的濕潤分散劑為IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)和月桂氮卓酮，二者比例為1∶1或1∶2，其與殺蟲真菌孢子的生物學相容性更好。
本發明更優選的穩定保護劑為羧甲基纖維素和變性淀粉，兩者的重量比為1∶1～10。
進一步的，所述真菌孢子可濕性粉劑中還可包含紫外線吸收劑，例如二氧化鈦、尿素、葉酸、活性炭等，所使用的濃度通常為1％。
優選的紫外線吸收劑為二氧化鈦。
本發明的制劑中還可以添加與真菌孢子生物學相容的其它助劑或增效劑，如本領域常用的增稠劑、防凍劑、滲透劑等。
優選的，所述真菌孢子可濕性粉劑中，各組分的重量百分比為真菌孢子粉62～75％，白炭黑10～15％，月桂氮卓酮5～8％，IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)3～5％，變性淀粉3～5％，羧甲基纖維素0.5～5％，二氧化鈦1％。
最優選的，所述真菌孢子可濕性粉劑中，各組分的重量百分比為真菌孢子粉73.5％，白炭黑10％，脂肪醇與環氧乙烷縮合物3.3％，月桂氮卓酮6.7％，羧甲基纖維素0.5％，變性淀粉5％，二氧化鈦1％。
本發明的可濕性粉劑可參照本領域的常規制備方法制備得到。在本發明的一個具體實施方式
中，先用載體對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與真菌孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
本發明所用的殺蟲真菌孢子粉可通過市售購買得到，也可通過平板培養或固體發酵生產殺蟲真菌孢子，分離孢子粉，干燥(含水量≤5％)，含孢量≥1.0×1011個/克)。
本發明所述可濕性粉劑的使用方法是將所述粉劑兌水噴霧，在田地中進行施用，具體使用量可根據實際情況進行調整，通常為5-20克/畝。
本發明對5種不同的濕潤劑和分散劑月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)、IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)、固體NNO(萘磺酸鹽甲醛縮合物)、SDS(十二烷基磺酸鈉)和MF(甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物)進行了篩選。在本發明的一個具體實施方案中，IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)對球孢白僵菌孢子的萌發和菌絲生長都沒有明顯影響，具有良好的生物學相容性。
殺蟲真菌孢子在貯藏過程中會有一定程度的代謝活動并積累一定量的代謝產物，通過選擇合適的保護劑來吸附或吸收這些對孢子可能有害的代謝產物，對孢子起一定的保護作用。本發明選擇了4種不同的穩定保護劑羧甲基纖維素，變性淀粉，甲基纖維素和β-環糊精。在一個具體實施方案中，4種穩定保護劑對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長都有不同程度的促進作用；在5.5％的比例水平上，變性淀粉與羧甲基纖維素對球孢白僵菌孢子的貯藏穩定性具有顯著的保護作用，能夠顯著提高孢子的活力。
以活體微生物為主要有效成分的生物殺蟲劑施用于田間后，日光中的紫外線是影響其活力的重要因素。一般情況下在幾十個小時內就完全失去活力。在制劑中加入一定量的抗紫外線吸收劑是必要的。本發明選擇了3種紫外線吸收劑抗壞血酸、二氧化鈦和氧化鋅。在其中一個實施方案中，3種紫外線吸收劑在1％濃度水平上對球孢白僵菌孢子的萌發有不同程度的促進作用；在對球孢白僵菌菌絲生長的影響方面，氧化鋅能促進菌絲的生長，二氧化鈦與抗壞血酸有一定的抑制作用；在1～0.1％范圍內，二氧化鈦對球孢白僵菌孢子的抗紫外線保護能力要顯著優于氧化鋅和抗壞血酸。
通過上述篩選得到與殺蟲真菌生物學相容的載體為白炭黑，濕潤分散劑為月桂氮卓酮和IW，穩定保護劑為變性淀粉和羧甲基纖維素，抗紫外線吸收劑為二氧化鈦。通過制劑配方的優化和15℃貯藏試驗，得到一個穩定性較好的配方以重量百分比計，真菌孢子粉73.5％；白炭黑(TB-2型)10％；IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)3.3％；月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)6.7％；羧甲基纖維素0.5％；變性淀粉5％；二氧化鈦1％。
本發明的優點在于1、制劑含孢量高，大于50％，而國內外已報道的殺蟲真菌可濕性粉劑的含孢量小于50％；2、貯存穩定性好，在15℃下穩定貯存18個月，活孢率仍在70％以上。
為了更好地理解本發明的本質，下面結合附圖
，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。
發明的
具體實施例方式
本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品。
本發明所用真菌孢子粉可通過市售購買得到，或者通過平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×1011個/克)后備用。市售孢子粉包括國內真菌高孢粉生產廠家(如湖北當陽白僵菌廠生產的白僵菌高孢粉)，高孢粉標準是含水量＜10％，含孢量＞1000億/克。
真菌孢子可濕性粉劑的配方篩選實施例1生物學相容的載體篩選本發明中選擇性能比較穩定的惰性載體一白炭黑(TB-2型)作為制劑的載體。白炭黑質地很輕，具有很強的吸附性能，而且自身有較好的水溶性，被國內外視為比較理想的生物農藥載體。本實施例中對白炭黑(TB-2型)與球孢白僵菌生物相容性進行檢測。
一、試驗方法(一)白炭黑對球孢白僵菌孢子萌發的影響將孢子粉與白炭黑(TB-2型)按一定比例配成孢子懸浮液，濃度為1.0％(重量體積比)，孢子濃度為1.0×106個/mL。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)平板上，26℃暗培養24hr后顯微鏡下檢測孢子的萌發率。孢子形成芽管的長度大于孢子直徑為孢子萌發的標準。采用隨機視野觀察100個孢子計數萌發的孢子，重復3次。以純孢子粉的萌發率為對照。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對萌發率計算方法如下 注萌發率A為孢子在一定濃度的被檢測物質中的萌發率。
(二)白炭黑對球孢白僵菌菌絲生長的影響將白炭黑(TB-2型)按1％(重量體積比)的比例加入1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)培養基中制成平板。用0.05％的Tween-80配成濃度為1.0×107個/mL的懸浮液。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培養。48hr后，用直徑為1.0cm的打孔器打取菌苔連同瓊脂塊倒置接種于含有1％白炭黑的1/4SDAY平板上，26℃暗培養。每天采用十字交叉法測量菌落直徑，共測量5次。以不含白炭黑的平板為對照。每個處理設3個重復。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對生長速率計算方法如下

注生長速率A為菌絲在含有被檢測物質的培養基上的生長速率。
二、試驗結果結果見表1。結果表明白炭黑在1％濃度下對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長均沒顯著的影響，與球孢白僵菌具有良好的生物學相容性。
表1白炭黑載體對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長的影響

實施例2生物學相容的濕潤劑和分散劑篩選在濕潤分散劑的篩選過程中，除了要求對孢子具有良好的濕潤分散性能外，由于濕潤劑與分散劑在使用過程中與孢子直接接觸，會破壞孢子表面的疏水結構，對孢子可能造成一定的損傷。所以制劑中所使用的濕潤劑與分散劑不但要有很好的濕潤分散性，而且必須與孢子具有很好的生物相容性(不抑制孢子的萌發和菌絲的生長)，盡量減少對孢子的損傷和避免在使用過程中影響制劑的殺蟲效果。本步驟中對5種不同的濕潤分散劑月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)、IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)、固體NNO(萘磺酸鹽甲醛縮合物)、SDS(十二烷基磺酸鈉)和MF(甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物)進行了篩選。
一、生物相容性測定
(一)試驗方法1、濕潤分散劑對孢子萌發的影響將球孢白僵菌孢子粉與濕潤分散劑按一定比例配成孢子懸浮液，各濕潤分散劑的濃度均為1.0％(重量體積比)，孢子濃度為1.0×106個/mL。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)平板上，26℃暗培養24hr后顯微鏡下檢測孢子的萌發率。孢子形成芽管的長度大于孢子直徑為孢子萌發的標準。采用隨機視野觀察100個孢子計數萌發的孢子。以不含濕潤分散劑的平板檢測設為對照。每個處理重復3次。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對萌發率計算方法如下 注萌發率A為孢子在一定濃度的被檢測物質中的萌發率。
2、濕潤分散劑對菌絲生長的影響將濕潤分散劑按1％(重量體積比)的比例加入1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)培養基中制成含有待檢測濕潤分散劑的平板。用0.05％的Tween-80配成濃度為1.0×107個/mL的懸浮液。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培養。48hr后，用直徑為1.0cm的打孔器打取菌苔連同瓊脂塊倒置接種于含有待檢測濕潤分散劑的平板上，26℃暗培養，每天采用十字交叉法測量菌落直徑，共測量5次。每個處理設3個重復。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對生長速率計算方法如下 注生長速率A為菌絲在含有被檢測物質的培養基上的生長速率。
(二)試驗結果結果見表2。從試驗結果可以看出，各濕潤分散劑之間對球孢白僵菌孢子的萌發和菌絲生長的影響都有顯著的差異(F5，12＝2926.80，P＜0.05和F5，12＝558.09，P＜0.05)。1％濃度下的SDS(十二烷基磺酸鈉)和MF(甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物)對球孢白僵菌孢子的萌發和菌絲生長都有顯著的抑制作用，其中SDS(十二烷基磺酸鈉)幾乎完全抑制了孢子的萌發和菌絲的生長；在相同濃度下IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)與對照沒有顯著差異，說明二者與孢子具有相對較好的生物學相容性。
表2濕潤分散劑對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長的影響

注IW為脂肪醇與環氧乙烷縮合物；SDS為十二烷基磺酸鈉；MF為甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物；固體NNO為萘磺酸鹽甲醛縮合物；月桂氮卓酮為1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮；數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Dunnett C，p＜0.05)二、濕潤分散劑對孢子濕潤分散能力的測定由于白僵菌孢子的表面是極度疏水，應該形成O/W型懸浮液，本發明選擇步驟2.1中篩選的2種與白僵菌生物學相容的濕潤分散劑IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)進行不同配比優化，測定濕潤性和分散性。IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)之間的配比設定為1∶1，1∶2，2∶1三個水平。將孢子粉、白炭黑載體與濕潤分散劑按照8∶1∶1的比例分散均勻，為待測樣品，以不加濕潤分散劑的樣品為對照。
(一)試驗方法濕潤分散劑的濕潤性測定方法如下向燒杯(250mL，內徑為6.5±0.5cm)中加入100±1mL標準水。將待測樣品準確稱取0.5g，從杯口位置一次倒入水中，同時啟動秒表計時，直至完全濕潤，記錄完全濕潤時間。重復3次，取3次平均值作為各樣品的濕潤時間。
分散性測定方法如下將待測樣品準確稱取0.25g倒入裝有一定量的標準水的燒杯中，用玻棒攪拌均勻后，轉移到具塞量筒中，水浴至30±1℃，并用同樣溫度的標準水補充到250mL，插上塞子。將量筒在1min內顛倒30次(上下顛倒180度再回到原位置為1次)。將量筒垂直放在水浴中，不能有振動，無直射日光。打開塞子取出100μL懸浮液，用血球計數板檢測懸浮液的孢子濃度。30min后，用注射器在10-15s內吸出225mL懸浮液，測定剩余的懸浮液中的孢子濃度。重復3次。懸浮率的計算方法如下

注a為制劑所配懸浮液的初始孢子數；b為抽去225mL后量筒中所剩余的制劑懸浮液的孢子數。
(二)試驗結果結果見表3。檢測結果表明IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)的不同配比對球孢白僵菌孢子的濕潤性有顯著差異，其中質量配比為1∶2的配方濕潤時間最短，質量配比為1∶1次之，質量配比為2∶1所用濕潤時間最長；在懸浮率方面，3個配方沒有顯著差異，都在90％以上。
表3濕潤分散劑對球孢白僵菌孢子的濕潤與分散性

注編號1，2，3分別指IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)之間質量配比的1∶1，1∶2，2∶1三個水平數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)實施例3生物學相容的穩定保護劑篩選孢子在貯藏過程中會有一定程度的代謝活動并積累一定量的代謝產物，在制劑中加入合適的穩定保護劑來吸附或吸收這些對孢子可能有害的代謝產物，對孢子起一定的保護作用。本實施方案中，對4種不同的穩定保護劑羧甲基纖維素，變性淀粉，甲基纖維素，β-環糊精，篩選了對球孢白僵菌生物相容性好和對孢子貯藏活力保護作用明顯的高分子材料。
一、穩定保護劑與球孢白僵菌的生物相容性測定(一)試驗方法1、穩定保護劑對孢子萌發的影響將孢子粉與穩定保護劑按一定比例配成孢子懸浮液，各穩定保護劑的濃度均為1.0％(重量體積比)，孢子濃度為1.0×106個/mL。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)平板上，26℃暗培養，24hr后顯微鏡下檢測孢子的萌發率。以不含保護劑的孢子懸液為對照。孢子形成芽管的長度大于孢子直徑為孢子萌發的標準。采用隨機視野觀察100個孢子計數萌發的孢子，重復3次。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對萌發率計算方法如下 注萌發率A為孢子在一定濃度的被檢測物質中的萌發率。
2、穩定保護劑對菌絲生長的影響將穩定保護劑按1％(重量體積比)的比例加入1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)培養基中制成含有待檢測穩定保護劑的平板。用0.05％的Tween-80配成濃度為1.0×107個/mL的懸浮液。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培養。48hr后，用直徑為1.0cm的打孔器打取菌苔連同瓊脂塊倒置接種于含有待檢測穩定保護劑的平板上，26℃暗培養，每天采用十字交叉法測量菌落直徑，共測量5次。每個處理設3個重復。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對生長速率計算方法如下 注生長速率A為菌絲在含有被檢測物質的培養基上的生長速率。
(二)試驗結果試驗結果見表4。結果表明，所篩選的4種穩定保護劑對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長都有不同程度的促進作用，表現出良好的生物學相容性。
表4穩定保護劑對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生長的影響

注數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)二、穩定保護劑對孢子貯藏活力的保護作用(一)試驗方法穩定保護劑與載體白炭黑和孢子粉按一定比例混合均勻后，裝入離心管中密封保存于25℃下，以不加穩定保護劑的處理為對照，6個月后取樣進行孢子活力測定。貯藏保護效能指數計算方法如下

(二)試驗結果貯藏試驗結果見表5。結果表明不同的穩定保護劑以及同一種穩定保護劑的不同濃度之間對球孢白僵菌孢子的貯藏穩定性有不同的影響。其中，在比例為5.5％水平上，變性淀粉與羧甲基纖維素對球孢白僵菌孢子的貯藏穩定性具有顯著的保護作用，并且優于其它2種保護劑。
表5穩定保護劑對孢子貯藏活力的保護作用


注數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)；保護效能指數為負值表示沒有保護作用。
實施例4紫外線吸收劑的篩選以活體微生物為主要有效成分的生物殺蟲劑施用于田間后，日光中的紫外線是影響其活力的重要因素，一般情況下在幾十個小時內就完全失去活力。因此，在制劑中加入一定量的抗紫外線吸收劑是必要的。本實施方案中，對紫外線吸收劑抗壞血酸、二氧化鈦和氧化鋅進行篩選。
一、生物學相容性測定(一)試驗方法1、紫外線吸收劑對球孢白僵菌孢子萌發的影響將球孢白僵菌孢子用0.05％Tween-80配成孢子懸浮液，然后將各紫外線吸收劑分別加入孢子懸浮液中，并調整濃度，使各保護劑的濃度均為1％(重量體積比)，孢子濃度為1.0×107個/mL。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)平板上，26℃暗培養24hr后顯微鏡下檢測孢子的萌發率。以不加紫外線吸收劑的孢子懸液為對照。孢子形成芽管的長度大于孢子直徑為孢子萌發的標準。采用隨機視野觀察100個孢子計數萌發的孢子。重復3次。用SPSS軟件對數據進行處理分析。相對萌發率的計算方法如下

注萌發率A為孢子在一定濃度的被檢測物質中的萌發率。
2、紫外線吸收劑對球孢白僵菌菌絲生長的影響將紫外線吸收劑按1％(重量體積比)的比例加入1/4 SDAY(以重量體積比計，葡萄糖1％，酵母膏0.25％，蛋白胨0.25％，瓊脂粉1.2％)培養基中制成含有待檢測紫外線吸收劑的平板。用0.05％的Tween-80配成濃度為1.0×107個/mL的懸浮液。取100μL孢子懸浮液均勻涂布于1/4 SDAY平板上，26℃暗培養。48hr后，用直徑為1.0cm的打孔器打取菌苔連同瓊脂塊倒置接種于含有待檢測濕潤分散劑的平板上，26℃暗培養，每天采用十字交叉法測量菌落直徑，共測量5次。每個處理設3個重復。用EXCEL和SPSS軟件對數據進行處理分析。相對生長速率計算方法如下

注A為菌絲在含有被檢測物質的培養基上的生長速率。
(二)試驗結果生物相容性試驗結果見表6。結果表明3種紫外線吸收劑在1％濃度水平上對球孢白僵菌孢子的萌發有不同程度的促進作用；在對球孢白僵菌菌絲生長的影響方面，氧化鋅能促進菌絲的生長，二氧化鈦與抗壞血酸有一定的抑制作用。
表6紫外線吸收劑對球孢白僵菌孢子萌發和菌絲生的影響

注數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)二、保護效能測定(一)試驗方法將球孢白僵菌孢子用0.05％Tween-80配成孢子懸浮液，然后將各紫外線吸收劑分別加入孢子懸浮液中，并分別調整到濃度為1％，0.5％，0.1％(重量體積比)，孢子濃度為1.0×107個/mL。取50μL涂布于無菌的蓋玻片上，每處理設3個重復，置于凈化工作臺上自然風干后，用紫外燈(8W，30cm)照射10min。然后將照射后的蓋玻片放入裝有10mL液體SDY(葡萄糖4％，酵母膏1％，蛋白胨1％；重量體積比)培養基的三角瓶中搖床暗培養(180r/min，26℃)。24hr后，顯微鏡下檢測孢子的萌發率。計算保護效能指數，計算方法如下

(二)試驗結果試驗結果見表7。結果表明，在0.1～1％水平上二氧化鈦對球孢白僵菌孢子的抗紫外線保護能力要顯著優于氧化鋅和抗壞血酸。
表7不同紫外線吸收劑對孢子的保護作用

注數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)根據實施例1，選擇白炭黑作為載體，在制劑中的比例為10～15％；根據實施例2，選擇IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)作為制劑的濕潤劑和分散劑，二者比例為1∶1或1∶2，在制劑中的總比例為10％左右；根據實施例3，選擇羧甲基纖維素和變性淀粉作為制劑的穩定保護劑，在制劑中的比例為5％左右；根據實施例4，選擇二氧化鈦作為紫外線吸收劑，在制劑中的比例為1％。
真菌孢子可濕性粉劑的制備
實施例5球孢白僵菌孢子可濕性粉劑的制備一、配方組分 含量(重量％)球孢白僵菌孢子粉 73.5％白炭黑10％IW3.3％月桂氮卓酮6.7％羧甲基纖維素 0.5％變性淀粉 5％二氧化鈦 1％二、制備方法先用載體白炭黑對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
所用球孢白僵菌孢子粉可由市售購買得到，也可由球孢白僵菌通過行平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×1011個/克)后備用。
實施例6球孢白僵菌孢子可濕性粉劑的制備一、配方組分含量(重量％)球孢白僵菌孢子粉65％白炭黑 15％IW 4.5％月桂氮卓酮 7.7％羧甲基纖維素4.5％變性淀粉3％二氧化鈦1％二、制備方法參見實施例5。
實施例7球孢白僵菌孢子可濕性粉劑的制備一、配方組分含量(重量％)球孢白僵菌孢子粉70％白炭黑 12％IW 4％月桂氮卓酮 6％羧甲基纖維素3％變性淀粉4％二氧化鈦1％二、制備方法參見實施例5。
實施例8球孢白僵菌孢子可濕性粉劑的制備組分含量(重量％)球孢白僵菌孢子粉55％白炭黑 22％IW 5％月桂氮卓酮 8％羧甲基纖維素3％變性淀粉5％二氧化鈦2％二、制備方法參見實施例5。
實施例9金龜子綠僵菌孢子可濕性粉劑的制備組分含量(重量％)金龜子綠僵菌孢子粉 70％白炭黑 15％IW 4％月桂氮卓酮 6％羧甲基纖維素1％變性淀粉3％
二氧化鈦 1％二、制備方法先用載體白炭黑對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
所用金龜子綠僵菌孢子粉可由金龜子綠僵菌通過行平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥5.0×109個/克)后備用。
實施例10蠟蚧輪枝菌孢子可濕性粉劑的制備組分 含量(重量％)蠟蚧輪枝菌孢子粉 65％白炭黑15％IW5％月桂氮卓酮8％羧甲基纖維素 1％變性淀粉 5％二氧化鈦 1％二、制備方法先用載體白炭黑對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
所用蠟蚧輪枝菌孢子粉可由蠟蚧輪枝菌通過行平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥2.0×109個/克)后備用。
實施例11粉擬青霉孢子可濕性粉劑的制備組分 含量(重量％)粉擬青霉孢子粉68％白炭黑12％IW5％月桂氮卓酮8％羧甲基纖維素 2％
變性淀粉 4％二氧化鈦 1％二、制備方法先用載體白炭黑對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
所用粉擬青霉孢子粉可由粉擬青霉通過行平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥2.0×109個/克)后備用。
實施例12湯普森被毛孢孢子可濕性粉劑的制備組分 含量(重量％)湯普森被毛孢孢子粉75％白炭黑11％IW3％月桂氮卓酮6％羧甲基纖維素 1％變性淀粉 3％二氧化鈦 1％二、制備方法先用載體白炭黑對濕潤分散劑按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加穩定保護劑，充分分散。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
所用湯普森被毛孢孢子粉可由湯普森被毛孢通過行平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×105個/克)后備用。
本發明真菌孢子可濕性粉劑的貯藏穩定性實施例131、孢子粉制備球孢白僵菌通過平板培養或固體發酵，經過產孢、收集、干燥(含水量≤5％，含孢量≥1.0×1011個/克)后備用。
2、制劑加工根據實施例1，選擇白炭黑(TB-2)作為載體，在制劑中的比例為10～15％；根據實施例2，選擇IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)與月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)作為制劑的濕潤劑和分散劑，二者比例為1∶1或1∶2，在制劑中的總比例為10％左右；根據實施例3，選擇羧甲基纖維素和變性淀粉作為制劑的穩定保護劑，在制劑中的比例為5％左右；根據實施例4，選擇二氧化鈦作為紫外線吸收劑，在制劑中的比例為1％。
孢子粉與助劑在不同配方中的比例見下表表8用于貯藏穩定性試驗的制劑配方表

先用載體白炭黑(TB-2型)對IW(脂肪醇與環氧乙烷縮合物)和月桂氮卓酮(1-十二烷基-六氫-2H-氮雜卓-2-酮)按比例進行充分的吸附吸收，然后依次添加羧甲基纖維素、變性淀粉、二氧化鈦。將分散均勻的混合物再與孢子粉充分混合，真空干燥使制劑含水量≤5％。
3、制劑貯藏與活力檢測用錫箔袋真空包裝加工好的制劑，5g/袋，置于15℃、干燥的環境中，每2～3個月取樣用平板法檢測制劑中孢子萌發率。經過18個月15℃后，4個配方制劑與純孢子粉之間的孢子活力出現了顯著差異，4個配方制劑的孢子活力均顯著高于對照(純孢子粉)；4個配方制劑之間也有顯著差異，其中配方C制劑的孢子活力仍保持在70％以上(見表8)。
表8不同配方制劑的貯藏試驗(15℃)


注A、B、C和D指步驟2中的制劑配方。數值后的小寫字母表示差異顯著性分析，同一列內含有相同字母表示差異不顯著(Duccan，p＜0.05)。
以上對本發明較佳實施方式的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種真菌孢子可濕性粉劑，由殺蟲真菌孢子粉和助劑組成，其特征在于，所述殺蟲真菌孢子粉在可濕性粉劑中的重量百分比為50～75％；所述助劑包括載體、濕潤分散劑和穩定保護劑；其中所述載體為白炭黑；所述濕潤分散劑為選自月桂氮卓酮、脂肪醇與環氧乙烷縮合物、固體萘磺酸鹽甲醛縮合物、甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物的一種或多種；所述穩定保護劑為選自羧甲基纖維素、變性淀粉、甲基纖維素、β-環糊精的一種或多種。
2.權利要求1所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，在所述助劑中，所述載體在可濕性粉劑中的重量百分比為10～15％、所述濕潤分散劑在可濕性粉劑中的重量百分比為5～20％、所述穩定保護劑在可濕性粉劑中的重量百分比為3～15％。
3.權利要求1所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述真菌孢子粉為選自白僵菌、綠僵菌、擬青霉、輪枝菌、野村菌和被毛孢的一種或多種真菌的孢子粉。
4.權利要求3所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述真菌孢子粉為白僵菌孢子粉。
5.權利要求1所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述濕潤分散劑為脂肪醇與環氧乙烷縮合物和月桂氮卓酮，兩者的重量比為1∶1或1∶2。
6.權利要求1所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述穩定保護劑為羧甲基纖維素和變性淀粉，兩者的重量比為1∶1～10。
7.權利要求1所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述真菌孢子可濕性粉劑進一步包含選自二氧化鈦、尿素、葉酸、活性炭的一種或多種的紫外線吸收劑，所述紫外吸收劑在可濕性粉劑中的重量百分比為1～2％。
8.權利要求7所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述紫外線吸收劑為二氧化鈦。
9.權利要求8所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述真菌孢子可濕性粉劑中，各組分重量百分比為真菌孢子粉62～75％，白炭黑10～15％，月桂氮卓酮5～8％，脂肪醇與環氧乙烷縮合物3～5％，變性淀粉3～5％，羧甲基纖維素0.5～5％，二氧化鈦1％。
10.權利要求9所述的真菌孢子可濕性粉劑，其特征在于，所述真菌孢子可濕性粉劑中，各組分重量百分比為真菌孢子粉73.5％，白炭黑10％，月桂氮卓酮6.7％，脂肪醇與環氧乙烷縮合物3.3％，變性淀粉5％，羧甲基纖維素0.5％，二氧化鈦1％。
全文摘要
本發明提供一種生物學穩定的真菌孢子可濕性粉劑，其由殺蟲真菌孢子粉和助劑組成，其中殺蟲真菌孢子粉在可濕性粉劑中的重量百分比為50～75％；所述助劑包括載體、濕潤分散劑和穩定保護劑；其中所述載體為白炭黑；所述濕潤分散劑為選自月桂氮卓酮、脂肪醇與環氧乙烷縮合物、固體萘磺酸鹽甲醛縮合物、甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物的一種或多種；所述穩定保護劑為選自羧甲基纖維素、變性淀粉、甲基纖維素、β－環糊精的一種或多種。本發明顯著延長了產品的貨架壽命，能夠滿足商業化生產的要求。
文檔編號A01N25/14GK1723780SQ200510080659
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月6日 優先權日2005年7月6日
發明者張永軍, 羅志兵, 裴炎 申請人:西南大學