專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，本發(fā)明還涉及該方法在腸屏障功能障礙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物體中，各種上皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞之間的連接，形成了保護(hù)組織的上皮屏障，包括腸上皮屏障、呼吸道上皮屏障等。相鄰上皮細(xì)胞之間的連接方式有很多種，其中緊密連接是最重要的連接方式之一。它可以調(diào)控水、可溶性物質(zhì)的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止一些毒性大分子和微生物的通過(guò)。這種通透性調(diào)節(jié)在維持上皮屏障方面起著重要作用(見(jiàn)圖1)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腸屏障功能障礙總是伴隨著腸上皮細(xì)胞緊密連接完整性的改變。如在克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎中，發(fā)現(xiàn)病變腸段的緊密連接受到明顯破壞，這種緊密連接完整性的改變被認(rèn)為是腸屏障功能障礙的一個(gè)重要特征。因此，腸上皮緊密連接完整性的測(cè)定對(duì)于腸屏障功能的監(jiān)測(cè)有重要意義。
目前，腸上皮緊密連接完整性的測(cè)定主要通過(guò)大分子物質(zhì)通透性試驗(yàn)進(jìn)行。緊密連接調(diào)控這些大分子物質(zhì)(乳果糖、纖維雙糖、EDTA和葡聚糖等)的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，大分子物質(zhì)通透性的改變可以間接反映緊密連接的完整性。但這種方法也存在缺陷，包括通透性易受血流量、腎功能等因素的影響，個(gè)體差異大。從解剖結(jié)構(gòu)上看，不同節(jié)段腸上皮緊密連接的完整性是不同的，正常小腸上皮細(xì)胞間緊密連接比結(jié)腸寬松，而大分子物質(zhì)通透性試驗(yàn)不能反映不同腸段緊密連接的完整性。
體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，上皮電阻抗(TEER)是反映單層細(xì)胞緊密連接完整性的一個(gè)重要指標(biāo)。根據(jù)生物電阻抗原理，緊密連接完整性的改變會(huì)引起上皮電阻抗的改變。TEER可以通過(guò)上皮細(xì)胞電位儀(EVOM)進(jìn)行測(cè)定。EVOM產(chǎn)生低頻電流作用到單層細(xì)胞，利用歐姆定律直接測(cè)出電阻值。目前，關(guān)于利用細(xì)胞電位儀(EVOM)測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的研究，未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、有效的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該方法在腸屏障功能障礙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案是根據(jù)低頻率(＜50Hz)下測(cè)定的腸上皮電阻抗反映腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性的原理。生物組織中，細(xì)胞外液的電子感應(yīng)度比細(xì)胞內(nèi)液大地多，低頻率電流無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)液，因此低頻率下測(cè)定的電阻抗是上皮細(xì)胞之間的電阻抗。緊密連接是細(xì)胞之間的重要結(jié)構(gòu)，緊密連接的完整性決定了細(xì)胞之間電阻抗值的高低。本發(fā)明技術(shù)利用該電生理特征進(jìn)行腸上皮電阻抗的測(cè)定，從而可以反映腸上皮緊密連接的完整性。
腸上皮細(xì)胞緊密連接是腸上皮屏障的重要組成部分，大量研究證明腸上皮屏障功能的破壞總是伴隨著緊密連接完整性的改變。因此，腸上皮電阻抗的降低可以反映腸屏障功能的破壞。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，該方法是通過(guò)體外測(cè)定動(dòng)物腸段的腸上皮電阻抗，根據(jù)腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。
所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮電阻抗的測(cè)定方法是將細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞小室去除聚乙烯膜，改為三腳中空的測(cè)試杯，然后將待測(cè)定部位的腸組織體外固定在測(cè)試杯上用于電阻抗測(cè)定。
所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮電阻抗的測(cè)定方法中腸標(biāo)本采用3-0絲線沿杯口套扎固定。
所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮組織電阻抗的測(cè)定方法中采用EVOM單值電流探頭和STX2電極測(cè)定腸上皮電阻抗。
上述的腸上皮緊密連接完整性的測(cè)定方法在腸屏障功能障礙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
以下結(jié)合圖2對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的描述1、腸標(biāo)本的獲取和固定。首先將細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞小室的聚乙烯膜去除，改為三腳中空的測(cè)試杯。將測(cè)試腸段(約1cm長(zhǎng))在充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)中沿系膜緣剪開(kāi)，小心浸洗去除腸內(nèi)容物，暴露腸粘膜面，保持組織平展，粘膜面向外固定在測(cè)試杯杯口上，然后將測(cè)試杯倒置于培養(yǎng)池中。腸組織將培養(yǎng)池分為上室和下室，分別加入200μl和1ml的37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液。
本發(fā)明所用的測(cè)試杯杯口直徑為6.5mm，面積為0.33cm2。腸標(biāo)本固定采用3-0絲線沿杯口套扎固定。培養(yǎng)池采用Transwell24孔培養(yǎng)板。
2、EVOM測(cè)定腸組織電阻抗。采用EVOM單值電流探頭和STX2電極。測(cè)試前，將STX2電極用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS沖洗。將STX2長(zhǎng)電極插入下室，短電極插入上室，腸組織位于兩個(gè)電極之間，保持位置恒定。測(cè)定三次取平均值。測(cè)得的電阻抗計(jì)算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω·cm2)公式中Rtotal為實(shí)測(cè)電阻值，Rblank為未固定腸組織的空白的電阻值，A為腸上皮面積。
3、該測(cè)定方法在腸屏障功能障礙實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。通過(guò)建立腸缺血缺氧、缺血再灌注損傷、炎性腸病、腸道細(xì)菌易位等動(dòng)物模型，測(cè)定腸屏障功能損傷時(shí)腸上皮電阻抗的變化，結(jié)合電鏡觀察緊密連接結(jié)構(gòu)，從而反映緊密連接完整性的改變。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將EVOM用于腸上皮電阻抗的測(cè)量。這是簡(jiǎn)單方便的，非破壞性的，可靠的檢測(cè)方法。本發(fā)明采用EVOM單值電流探頭和STX2電極，產(chǎn)生低頻交流電流作用到腸上皮組織，對(duì)組織不會(huì)造成損傷，電阻抗值在緊密連接受損時(shí)變化靈敏準(zhǔn)確，可以真實(shí)反映不同部位腸段緊密連接的完整性。本發(fā)明從動(dòng)物的少量腸組織標(biāo)本中能夠有效檢測(cè)出數(shù)據(jù)，僅需幾分鐘，所用樣本量小，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便，不受血流量和機(jī)體代謝的影響。
緊密連接完整性的重要性在腸缺血缺氧、缺血再灌注、炎性腸病、創(chuàng)傷應(yīng)激、腸道細(xì)菌異位等腸屏障功能障礙的研究中得到證實(shí)，已成為當(dāng)今腸屏障功能研究中的熱點(diǎn)。本發(fā)明方法通過(guò)測(cè)定腸上皮電阻抗，為緊密連接完整性的檢測(cè)提供了新的方法和指標(biāo)，可用于腸屏障功能障礙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。


圖1是腸上皮緊密連接示意圖。
圖2是EVOM測(cè)定腸上皮電阻抗示意圖。
圖3是腸組織標(biāo)本固定的實(shí)物圖。
圖4是EVOM測(cè)定腸組織電阻抗的實(shí)物圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
以下實(shí)施例所用的實(shí)驗(yàn)材料為250-300g雄性SD大鼠，KRB緩沖液(NaCl 119mM，KCl 4.74mM，CaCl22.54mM，MgCl21.19mM，Na2HPO41.19mM，NaHCO325mM，HEPES 10mM，Glucose 5.5mM，PH7.4)，單層細(xì)胞小室(Transwell Insert，Corning，USA)，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Transwell，Corning，NY，USA)，EVOM細(xì)胞電位儀(WPI，Aston，England)，STX2電極(WPI，F(xiàn)lorida，USA)，動(dòng)物手術(shù)器械，3-0絲線，氯胺酮。
實(shí)施例1測(cè)定正常大鼠不同部位腸上皮電阻抗值1、將SD大鼠肌注鹽酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，劍突下腹部中線切口開(kāi)腹，迅速取近端空腸(距屈氏韌帶2cm)、末端回腸(距盲腸2cm處)、橫結(jié)腸各1cm，保存在4℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中，20分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。
2、將單層細(xì)胞小室的聚乙烯膜去除，改造為三腳中空的測(cè)試杯。在充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中將測(cè)試腸段沿系膜緣剪開(kāi)，小心浸洗去除腸內(nèi)容物，暴露腸粘膜面，粘膜面向外平展在測(cè)試杯杯口上，3-0絲線沿杯口套扎固定，剪去多余腸組織，然后將測(cè)試杯置于37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中保持組織活性。(見(jiàn)圖3)3、將固定好的測(cè)試杯杯口向下倒置于培養(yǎng)池中，測(cè)試杯杯腳懸掛在培養(yǎng)池外壁，腸組織將培養(yǎng)池分為上室和下室，分別加入200μl和1ml的37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液。
4、測(cè)試前，將STX2電極用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS沖洗。將EVOM細(xì)胞電位儀打開(kāi)，測(cè)試檔調(diào)在R，量程調(diào)至2000Ω，調(diào)零后將STX2長(zhǎng)電極插入下室，短電極插入上室，腸組織位于兩個(gè)電極之間，保持位置恒定。測(cè)定三次取平均值，得到腸上皮電阻抗。(見(jiàn)圖4)測(cè)得的電阻抗計(jì)算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω.cm2)公式中Rtotal為實(shí)測(cè)電阻值，Rblank為未固定腸組織的空白的電阻值，A為腸上皮面積。
本實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照電阻抗為100Ω，腸上皮面積為0.33cm2。
5、根據(jù)結(jié)果(見(jiàn)表1)可以得出正常大鼠不同節(jié)段腸上皮的電阻抗，符合文獻(xiàn)報(bào)道的正常小腸上皮細(xì)胞間緊密連接比結(jié)腸緊密連接寬松的解剖特點(diǎn)。
表1 正常SD大鼠不同部位腸上皮電阻抗測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例2測(cè)定腸缺血再灌注損傷后大鼠腸上皮電阻抗的變化1、選用250-300g雄性SD大鼠，隨機(jī)分為四組(每組10只)對(duì)照組，缺血再灌注損傷1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)組。
2、將試驗(yàn)組大鼠肌注鹽酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，劍突下腹部中線切口開(kāi)腹，分離腸系膜上動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)微血管夾將其夾閉使腸缺血。缺血60分鐘再次麻醉(肌注50mg/kg鹽酸氯胺酮)松開(kāi)微血管夾，分別于松開(kāi)血管夾后1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)取測(cè)試腸段。對(duì)照組行假手術(shù)。
3、從大鼠體內(nèi)迅速取近端空腸(距屈氏韌帶2cm)、末端回腸(距盲腸2cm處)、橫結(jié)腸各1cm。按實(shí)施例1所述方法測(cè)定各組大鼠不同部位腸上皮電阻抗值。對(duì)所測(cè)得的電阻抗值采用單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異，P＜0.01認(rèn)為有極顯著差異。
4、另分別于近端空腸、末端回腸、橫結(jié)腸各取1cm腸段戊二醛固定，透射電鏡觀察緊密連接結(jié)構(gòu)改變。
5、根據(jù)結(jié)果(見(jiàn)表2)可以發(fā)現(xiàn)大鼠腸上皮電阻抗值隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而降低，回、結(jié)腸電阻抗值變化較空腸更為明顯。腸上皮電阻抗的改變和電鏡下緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞程度相符。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了腸上皮電阻抗隨著緊密連接完整性的破壞而降低，且不同部位腸上皮緊密連接破壞程度不同。
表2 缺血再灌注損傷大鼠腸上皮電阻抗測(cè)定結(jié)果

*P＜0.05，**P＜0.0權(quán)利要求
1.一種測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于通過(guò)體外測(cè)定動(dòng)物腸段的腸上皮電阻抗，根據(jù)腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮電阻抗的測(cè)定方法是將細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞小室去除聚乙烯膜，改為三腳中空的測(cè)試杯，然后將待測(cè)定部位的腸組織體外固定在測(cè)試杯上用于電阻抗測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮電阻抗的測(cè)定方法中腸標(biāo)本采用3-0絲線沿杯口套扎固定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮組織電阻抗的測(cè)定方法中采用EVOM單值電流探頭和STX2電極測(cè)定腸上皮電阻抗。
5.權(quán)利要求1所述的腸上皮緊密連接完整性的測(cè)定方法在腸屏障功能障礙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定腸上皮緊密連接完整性的方法及其應(yīng)用。該方法通過(guò)體外測(cè)定動(dòng)物腸段的腸上皮電阻抗，根據(jù)腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。該方法操作簡(jiǎn)單方便，所用樣本量小，不受血流量和機(jī)體代謝的影響，可有效反映不同節(jié)段腸上皮緊密連接的完整性。該方法可用于腸屏障功能障礙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
文檔編號(hào)A61D99/00GK1883385SQ20061004079
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日
發(fā)明者李寧, 王萌, 李秋榮, 黎介壽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院