專利名稱：一株具殺線蟲活力的曲霉屬真菌及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的真菌及其制備方法和應用。
背景技術：
植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區發生和為害，種類多種多樣。在全球范圍內，植物寄生線蟲的發生與危害隨著農林業的發展和耕作栽培制度的變化日益嚴重，據Esser統計，到1990年為止全世界已報道發現植物寄生線蟲207屬4832種(劉維志，段玉璽.2000.植物病原線蟲學.北京中國農業出版社，p1-2)。據估計，植物寄生線蟲造成世界主要農作物的年損失率為12.3％，超過1000億美元，而實際的損失遠遠超過估計，理由是許多線蟲造成的危害因沒有田間可見癥狀或?；蕴卣鞫匆鹱⒁?王壽華.果樹線蟲學.北京中國農業科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范圍內對線蟲為害的新發現還在不斷增加，而且一些更新的農業栽培體制使線蟲問題更加突出，再者，線蟲與其它生物相互作用而對植物產生的直接或間接影響還在急劇增加。從這種意義上說，線蟲造成的危害較其它生物更加隱蔽！目前對植物有害的線蟲約有3000多種，在我國主要有根結線蟲、胞囊線蟲、松材線蟲、甘薯莖線蟲等。根結線蟲是農業上為害最大的一類線蟲，病害發生后，一般減產10％左右，嚴重的高達75％以上，甚至絕收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CABInternational)。目前，植物寄生線蟲的防治仍以化學防治為主，但近年來，化學殺線劑的應用浪費大，污染環境，選擇性差，滅生性強，破壞土壤生物區系等弊端日益為人們所重視(張克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和細菌在線蟲生防中的作用及其研究進展.殺蟲微生物.355-66)，21世紀稱為環保世紀，一些有效的化學殺線劑的應用逐步受到限制，因此對植物寄生線蟲的生物防治研究自然成為熱點問題。本發明正是基于上述理論，以植物寄生線蟲為靶標，從真菌代謝產物中尋找具有高效殺線蟲活性物質，擬為研究開發新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。

發明內容
本發明的目的是選擇對根結線蟲具高殺蟲活性的真菌菌株，將菌株按常規液體發酵培養后，從代謝產物中提取具殺線蟲活性物質的有效成分，開發殺線蟲生物農藥，其中，所述的根結線蟲優選是南方根結線蟲。
本發明篩選到的一株具有殺線蟲活性的真菌菌株是Aspergillus niger snf0407009，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2006年5月18日；保藏登記入冊的編號CGMCC No.1714。Aspergillus nigersnf0407009是從大量土壤真菌菌株中篩選出的一株對南方根結線蟲具有良好殺線蟲活性的真菌菌株。
本發明通過研究發現，土壤真菌有很多株真菌都具有較高的殺線蟲活性，從這些真菌中篩選出一株性狀相對最好的真菌菌株A.niger snf0407009進行了進一步的研究。
本發明還涉及用于防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，其是由本發明的真菌菌株A.nigersnf0407009經過常規的液體發酵培養后提取制備的。
本發明的真菌菌株A.niger snf0407009是通過試管種培養后，再經擴大發酵培養來制備，其具體方法如下1.試管種培養培養基配方為馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基，即馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂17g；水1000mL。
2.液體發酵培養其中液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有蔗糖2％-6％、硫酸銨1％-7％、K2HPO40.01％-2.00％、MgSO4·7H2O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO40.002-0.04％，余下為水，pH為6-7，優選pH為6.5。
將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養基中，25℃～28℃下，搖床轉速以150r·min-1～200r·min-1、發酵240h。
本發明還涉及一種殺線蟲制劑，其包含有效量的本發明所述的真菌菌株A.nigersnf0407009本身或其代謝物作為有效活性成分。
本發明的真菌菌株A.niger snf0407009或其代謝物具有殺線蟲活性物質，可用于植物寄生線蟲的生物防治，特別是根結線蟲(Meloidogyne spp.)。
具體實施例方式為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。
首先對A.niger snf0407009菌株進行發酵培養，然后對發酵培養后的代謝產物進行殺線蟲活性試驗，確定其對線蟲的作用。
實施例1菌株A.niger snf0407009的培養將A.niger snf0407009的菌絲體接種到試管瓊脂培養基上，培養基配方為PDA培養基，即馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂17g；水1000mL。25℃培養10d，獲得試管種。
再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養基中，培養基配方為(重量百分比)蔗糖(2.83％)、硫酸銨(1.367％)、K2HPO4(0.064％)、MgSO4·7H2O(0.182％)、KCl(0.996％)、FeSO4(0.02％)，余下為水，pH 6.5。25℃～28℃下，搖床轉速以150r·min-1～200r·min-1、發酵240h。將發酵液配成不同的倍數進行殺線蟲藥效試驗。
實施例2菌株A.niger snf0407009的培養基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為液體培養基配方為蔗糖(3％)、硫酸銨(5％)、K2HPO4(0.08％)、MgSO4·7H2O(0.4％)、KCl(2.0％)、FeSO4(0.002％)，pH 7。
實施例3菌株A.niger snf0407009的培養基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為液體培養基配方為蔗糖(6％)、硫酸銨(3％)、K2HPO4(2％)、MgSO4·7H2O(0.5％)、KCl(5.2％)、FeSO4(0.04％)，pH 6。
實施例4菌株A.niger snf0407009的培養基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為液體培養基配方為蔗糖(5％)、硫酸銨(7％)、K2HPO4(1.5％)、MgSO4·7H2O(0.3％)、KCl(4.5％)、FeSO4(0.01％)，pH 6.8。
實施例5菌株A.niger snf0407009的殺線蟲活性將發酵液濃縮5倍液的基礎上依次稀釋為-5×(濃縮5倍液)、1×、5×、10×、20×、，分別對南方根結線蟲2齡幼蟲。
1.制備試驗用制劑按前述液體發酵培養方法制備的真菌菌株A.niger snf0407009，用不同倍數的發酵液進行殺線蟲活性試驗。
2.制備試驗用線蟲(1)制備南方根結線蟲卵囊、卵及2齡幼蟲根結線蟲在溫室中用番茄(品種新L-402番茄，黑龍江省富拉爾基農業科研所)繁殖，待病株產生大量卵囊時，將病根取出洗凈。于解剖鏡下挑取卵囊，放入直徑9cm的培養皿內，用0.5％NaOCl表面消毒3min，無菌水洗3次后備用。將經消毒后的卵囊放入墊有2層擦鏡紙的線蟲分離器中，在室溫下孵化3d～4d，便可得到大量純2齡幼蟲。將病根洗凈，剪成0.5cm～1cm的小段，放入500mL三角瓶中，加1％NaOCl 200mL劇烈震蕩5min，用200目及500目網篩反復沖洗收集，在500目篩子中可收集到純凈的線蟲卵。
3.試驗方法
3.1 A.niger snf0407009代謝物對線蟲的作用在經滅菌的特制的貝氏小皿內中加入不同濃度的試驗用發酵液各1mL，以加1mL無菌水作為對照，然后分別向處理和對照中各加入100μL線蟲懸浮液(約含線蟲100條)，放入25℃培養箱中，24h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率即為殺線蟲藥效。每處理重復3次。
3.2 A.niger snf0407009代謝物對南方方根結線蟲卵囊孵化的作用在每個經高溫滅菌的培養皿(直徑6cm)中放入2個表面消毒的發育較一致的卵囊，分別加入5mL不同濃度的試驗用發酵液，以加入5mL無菌水作為對照。試驗在25℃下進行，將各處理培養皿用封口膜封嚴，以減少污染以及液體蒸發。10d后鏡檢各處理卵囊孵化情況。計算卵囊孵化線蟲數和卵囊孵化的相對抑制率。每處理重復3次。
4.試驗結果(1)A.niger snf0407009代謝物對南方根結線蟲2齡幼蟲的殺線蟲效果表1發酵液不同稀釋倍數對南方根結線蟲2齡幼蟲的影響 結果表明，各稀釋濃度的發酵液和無菌水對照之間差異顯著，濃縮5倍、1倍液和10μg/ml涕滅威對線蟲的相對致死率都達到了90％以上，三者之間差異不顯著。
(2)A.niger snf0407009代謝物對南方根結線蟲卵囊孵化的作用表2曲霉發酵液不同稀釋倍數對南方根結線蟲卵囊孵化的影響

結果表明，各稀釋濃度的發酵液和無菌水對照處理的卵囊之間，對線蟲孵化影響差異顯著，特別是濃縮5倍和1倍液幾乎不能孵化，與10μg/ml涕滅威抑制率相當，其相對抑制率都達到95％以上。
通過對兩種線蟲殺線蟲和對卵囊孵化的抑制作用試驗結果表明，A.niger snf0407009是一株極具有應用價值的真菌，特別是對南方根結線蟲的殺線蟲作用和對其卵囊孵化的抑制作用，顯示出其良好的應用開發前景。
權利要求
1.一株具有殺線蟲活性的真菌，其特征在于該菌株為Aspergillus niger，已于2006年4月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1714。
2.一株防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，其特征在于，是由權利要求1所述的真菌經過常規的液體發酵提取制備的，液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有蔗糖2％-6％、硫酸銨1％-7％、K2HPO40.01％-2.00％、MgSO4·7H2O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO40.002-0.04％，pH為6-7。
3.根據權利要求2所述的真菌代謝物，其特征在于，pH為6.5。
4.權利要求1所述的具有殺線蟲活性的真菌的制備方法，包括生產菌株經過常規的液體發酵后制備殺線蟲制劑，其特征在于該真菌的液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有蔗糖2％-6％、硫酸銨1％-7％、K2HPO40.01％-2.00％、MgSO4·7H2O 0.1％-0.5％、KCl 0.01％-5.2％、FeSO40.002-0.04％，pH為6-7。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，pH為6.5。
6.一種殺線蟲制劑，其特征在于，包含有效量的權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌代謝物作為活性成分。
7.權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌代謝物或權利要求6所述的殺線蟲制劑在植物寄生線蟲生物防治中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的植物寄生線蟲為根結線蟲(Meloidogynespp.)。
全文摘要
本發明涉及一株具毒殺植物寄生線蟲作用的真菌的培養及其代謝物制備方法和應用，屬于微生物農藥技術領域。本發明涉及的真菌菌株Asipergillus.niger snf0407009，已于2006年5月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1714。snf0407009的分類地位是有絲分裂孢子菌類，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黑曲霉。通過常規液體發酵培養制備，其代謝物對植物寄生線蟲，特別是根結線蟲具有毒力高，殺線蟲效果明顯的突出特點，室內測定本菌株發酵液對南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)2齡幼蟲和卵囊孵化的影響。不同稀釋濃度發酵液的處理和無菌水處理有顯著差異，發酵液的1倍液以上濃度與10μg/ml涕滅威的防效相當。具良好的應用開發前景。
文檔編號A01P5/00GK1891812SQ200610081200
公開日2007年1月10日 申請日期2006年5月25日 優先權日2006年5月25日
發明者段玉璽, 朱曉峰, 陳立杰 申請人:沈陽農業大學