專利名稱：：一種向單個鳥卵注射方法
技術領域：
：本發明涉及一種向鳥卵注射的方法，特別是涉及一種向單個鳥卵定點、定量注射的方法，尤其適合于自然孵化狀態下的晚成雛小型鳥卵的胚胎各期注射。
背景技術：
：鳥類為卵生動物，它的胚胎發育是離開母體的，有利于運用轉基因技術、胚胎干細胞技術、人工授精技術、動物克隆技術及放射性同位素標記示蹤技術等現代生物學技術對其個體發育進行研究。與雞、鴨、鵝等^大型卵相比，白腰文鳥、鸚鵡、金絲雀等小型鳥卵具有卵殼薄，易開口，內容物體積小等特點。注射成功率易受溫度、注射物體積、機械損傷等因素的影響，要想在保證較高出殼率和成活率的前提下有效完成定點、定量注射，一套合適的向鳥卵內定點、定量注射物質的方法尤為關鍵。傳統的單卵注射方法通常使用醫學注射器或微量進樣器，在側光照射下進行注射。這種方法不但注射位置不精確，注射深度不易控制，對鳥卵的損傷大，且注射后，針內存藥量大，浪費注射物質。另外，注射針通常被循環使用，容易引起交叉感染，降低鳥卵的出殼率、成活率。傳統方法的另一不足之處在于，未能很好地解決中小型鳥卵定點、定量注射問題，給相關研究帶來極大不便。中國專利02105130.5和99815436.9的方法比較適合人工孵化的大中型早成雛鳥卵(如雞、鴨等)的工業化批量注射，不但設備昂貴，而且無法杜絕注射過程中的交叉感染問題；同時也無法解決注射時鳥卵的朝向位置與孵化過程中的晚成雛鳥卵自然孵化朝向位置一致的問題。(因二者均須預先將鳥卵的朝向位置調整成鈍端氣室向上，然后利用注射針經鳥卵鈍端的氣室進行注射)另外，針對小型鳥卵，如白腰文鳥卵、金絲雀鳥卵、鸚鵡鳥卵等小型鳥卵，會因注射入一定體積的物質后卵中的內容物體積增大，而出現內容物(包括注射物質)從卵殼上開口處溢出的現象，不易完成定量注射，也不易封口，對于注射同位素標記的物質也容易造成環境污染。若開口處卵殼下有重要的結構，開口時易造成此重要結構的損傷。以上所述問題，其他相關專利均未解決。
發明內容本發明的目的在于，為解決上述問題，提供成本較低，無污染，可提高出殼率及成活率的一種向鳥卵注射的方法。本發明涉及一種向單個鳥卵定點、定量注射的方法，其操作步驟如下1、將鳥卵在孵化溫度下定位在預定的朝向位置；2、在卵殼上欲注射位置旁l-2mm處選擇開口位置并用酒精消毒；3、用消毒的實心針在卵殼上的開口位置以及其下的外殼膜、內殼膜上同時制成一個同等大小的小開口，直徑小于2mm。4、輕輕轉動鳥卵使卵內欲注射位置與卵殼上的小開口對準；5、通過小開口伸入一個已消毒的一次性注射針；6、通過一次性注射針向卵中注射物質；7、將卵在低于孵華溫度l-l(TC環境下降溫1秒至10秒或小于10分鐘;8、收回一次性注射針；9、使鳥卵在縱切面內轉動5-45°，使注射針道口偏離卵殼上的開口；10、用融化的石蠟封閉開口；11、在孵化溫度下待石蠟凝固；12、將鳥卵放回原處孵化。本發明的優點在于1.成本較低本方法以傳統的生理學儀器——玻璃微電極作為注射工具，使用時將其連接在移液槍上，因此，成本低廉。2.操作快捷自然孵化狀態下，鳥卵的長軸一般呈水平位置，而鈍端氣室位于側方。本方法注射時不須經過氣室，卵的朝向位置與自然孵化狀態下的朝向位置一致，從鳥巢中取出的卵直接可按照本方法注射，不需要再另花費時間調整其鈍端位置，從而從根本上節約了時間。同時，避免了長時間放置過程中環境的改變對胚胎發育以及出殼率及成活率的影響，更適合由親鳥孵化的卵，尤其適合由親鳥孵化的小型晚成雛鳥卵。3.單卵注射鳥卵在胚胎發育過程中胚胎逐漸由相對靜止狀態轉變為相對運動狀態。中期的胚胎通常^卵中成無規律的轉動或泳動(在透射光下肉眼清晰可見)。單卵注射可以針對不同的具體情況瞬時注射，針對性更強。更適合由親鳥孵化的卵，以及由親鳥孵化的小型晚成雛鳥卵，尤其是珍稀鳥卵的注射。4.刺激小、損傷小影響注射后的鳥卵出殼率及成活率的主要因素之一就是注射導致的卵的損傷程度。大的刺激或損傷，往往大幅度地降低出殼率及成活率。本方法使用的注射針為玻璃微電極，針尖端細，直徑低于100微米，甚至低于20微米，減小了進針及注射時的機械損傷；在蛋殼上所需的開口小，不但便于封閉，而且對卵的機械損傷也小；石蠟封口結實，不易被親鳥詠掉造成意外機械損傷。另外，在封口前將鳥卵轉動一定角度，以使重要生物結構，如血管、胚盤等i開開口，而使卵清等只具營養作用的非重要結構面對開口，然后用石蠟等封閉劑封閉，避免了封閉劑對重要結構的刺激及損傷。另外，由于鳥卵小、殼薄，對溫度變化比較敏感，本方法大部分處理在孵化溫度下進行，減小了溫度變化對卵的刺激和影響。這些都可以在總體上降低了對卵的剌激和機械損傷，從而提高了出殼率及成活率。5.無污染本方法使用一次性注射針作為注射工具，可以避免交叉感染；傳統的方法在蛋殼上的開口大，通常使用防水膠和封閉劑封口，而本方法開口很小，用石蠟作為封口材料，無毒、無異味，封口牢固，隔離性好，不易自然脫落或被親鳥啄掉，避免了污染物進入卵內。因此，本方法能獲得較高的出殼率及成活率(見表一)。另外，注射后先行降溫處理，避免了內容物以及注射物質從開口溢出，從而避免對卵外環境的污染。6.定點、定量注射要想在后期研究中進行定量分析，定點、定量注射尤為關鍵。利用本法注射時，注射針不需經過氣室，且注射針帶有刻度。因此，注射針進入卵內的深度容易控制，可實現精確的定點注射。本方法使用的玻璃微電極與移液槍相連，可以實現定量取樣、定量注射。本法在完成注射步驟后，須對鳥卵進行降溫處理，乃是利用熱脹冷縮的原理降低卵內物體的溫度，使卵內物質體積減小，從而避免卵內物質溢出，還可使溢出的液滴回納，從而保證定量注射。7.直觀傳統的鳥卵注射法通常使用金屬針頭注射，僅靠肉眼難以觀察到針頭中的存藥量及氣泡。而本法使用玻璃材料作為注射針，注射針內的液面及氣泡肉眼清晰可見，直觀、便捷。具體實施例方式本發明涉及一種巧單個鳥卵定點、定量注射的方法，其操作步驟如下-a、將鳥卵在孵化溫度下定位在預定的朝向位置。即將鳥卵放置于臺式照蛋器的光源孔上方，并使其與自然孵化的朝向位置一致；b、在卵殼上欲注射位置旁l-2mm處選擇開口位置并用酒精消毒；c、用消毒的實心針在卵殼上的開口位置以及其下的外殼膜、內殼膜上同時制成一個同等大小的小開口，直徑小于2mm;d、輕輕轉動鳥卵使卵內欲注射位置與卵殼上的小開口對準；e、通過小開口伸入一個己消毒的一次性注射針；f、通過一次性注射針向卵中注射物質；g、將卵在低于孵化溫度l-l0C環境下降溫1秒至10秒或小于10分鐘。此溫度及時間的控制可根據鳥卵的大小等情況而定。同樣大小的鳥卵，以使其注射后卵內物質不溢出小開口為宜。降溫幅度越大，所需的時間越短;降溫幅度越小，所需的時間越長；h、收回一次性注射針；i、使鳥卵在縱切面內轉動5-45。，使注射針道口偏離卵殼上的開口，且開口處無重要的結fe;j、用融化的石蠟封閉開口；k、在孵化溫度下待石蠟凝固；1、將鳥卵放回原處孵化。所述的孵化溫度是指與鳥卵自然孵化相一致的溫度范圍。所述鳥卵的預定朝向位置包括與自然人工孵化狀態下的朝向位置或者自然親鳥孵化狀態下的朝向位置以及自然放置狀態下的朝向位置相一致的位置，優選的方案為鳥卵的鈍端氣室位于側方或鳥卵的長軸處于水平位置。注射時，注射針不經過氣室進行注射。自然孵化狀態下，白腰文鳥卵、金絲雀卵、麻雀卵、鴿卵等各種晚成雛鳥卵，以及自然孵化中的雞、鴨、鵝、鵪鶉等早成雛卵的取向大多數為長軸處于水平或鈍端氣i位于側方。因此本發明特別適合于自然孵化中的鳥卵的注射，尤其適合于小型晚成雛鳥卵(如白腰文鳥卵、金絲雀卵、麻雀卵、各種鴿卵等)的注射以及珍稀鳥卵的注射。注射前，將鳥卵放置于臺式照蛋器的透光孔處，并處于與自然孵化的朝向位置相一致的位置，使得透射光自鳥卵的下方照射。這樣鳥卵放置平穩，不易滾動，內部結構清晰可辨，便于觀察及徒手操作。簡易的臺式照蛋器可由一個簡單電路中的燈泡和一個臺式機體組成，在臺式機體的中央有一個透光孔，燈泡位于透光孔下方，透光孔上方有一個凹坑。使用時將卵放于透光孔上方的凹坑中。提高工作效率的臺式照蛋器可見于中國專利200520093870.4。所述鳥卵為有生命的鳥卵，含有胚盤或者任何時期的胚胎，其發育時期判斷的方法是利用臺式照蛋器照射，根據胚胎發育不同時期的蛋相區分。所述的在卵殼上欲注射位置旁卜2mm處選擇開口位置(此處卵殼下也需無重要的結構)，開口后再將欲注射位置對準開口進行注射，是因為開口的實心針較粗，卵殼很薄，在開口時容易在注射前就提前損傷欲注射位置處的重要結構，進而影響后期胚胎發育及出殼率。而如此處理，因注射針很細，與實心針的直徑不在同一個數量級，因此對欲注射位置及其相對應的位置產生的損傷很小，這樣可將機械損傷對卵后期胚胎發育、出殼率、成活率的影響減至最低。'所述小開口位于卵的朝上一面，是為位于卵殼、外殼膜、內殼膜上的同等大小的直徑小于2mm的小開口，可處于非氣室處任何位置。開口越小，對卵的損傷越小，越便于封閉，封閉時封閉劑與卵內物質接觸的面積越小，對卵的剌激越小，這樣對胚胎的影響越小，對出殼率、成活率的影響也越小。注射位置可以選擇血管附近、胚盤附近或胚胎附近，根據需要選擇位于卵中任意深度的位置q也可以選擇到胚盤、胚胎、卵黃、卵清、血管周圍、血管內及其周圍位置。所述一次性注射針為用微電極拉制器拉制而成的玻璃微電極，尖端直徑小于500微米，也可小于100微米，甚至小于20微米。可根據需要選擇尖端直徑盡可能細的玻璃微電極。尖端越細，注射時對卵的機械損傷越小。并且，玻璃微電極從尖端開始標記有刻度，這樣可精確控制注射深度。另外，玻璃透明，注射更直觀。所述一次性注射fj"的另一端通過軟管與微量移液槍相連，在軟管內存有一定量的無毒無害的非注射液體，如石蠟油等。在非注射液體和注射針內的欲注射物質之間以及非注射液體和移液槍之間有空腔。操作時，將一次性注射針的針尖部分插入液面下，通過移液槍的抽吸作用吸取一定量的欲注射物質。注射時，將針尖自小開口插入卵內欲注射結構中(深度以卵殼為參照，由注射針上的刻度所示)，按下移液槍的按鈕，將物質注入卵內，實現定點定量注射。所述一次性注射針為消毒后使用。使用后，可從軟管端拔下，再換上新的注射針。每根僅使用一次，無污染，也可避免交叉感染，從而提高出殼率和成活率。所述的注射物質可以包括核酸、核苷酸、抗生素、維生素、病毒、疫苗、激素、肽、異體細胞等，以及含有放射性同位素的或已被熒光標記的上述f物質，或可用于向卵中注射的任何物質。步驟a-f在孵化溫度下進行，可使卵內處于自然狀態。注射后因卵內容物體積增大，壓力增大，抽出注射針時，卵內容物(包括注射物質)會從卵殼開口溢出，不易完成定量注射控制，也不易封口，對于注射同位素標記的物質也容易造成環境污染。而根據熱脹冷縮的原理，通過步驟g先行降溫可使其卵內容物體積減小，如此可使開口處的液面控制在卵殼下，避免注射物質的溢出損失，以便封口，可很好的解決上述問題，尤其對小型鳥卵，此步驟非常關會。步驟i的目的是避免封口時破壞及刺激注射位置處的重要結構，并避免破壞或阻斷營養來源。通過該步驟使卵清等不重要的結構與開口相對，讓這些不重要的結構在封閉時與封閉劑直接接觸，可減小對注射位置及針道的影響，從而有利于處理后的卵盡可能快地恢復正常發育。本發明進一步包括將處理后的鳥卵放回原處，即原來所處的親鳥孵化的鳥巢或者孵化箱，進一步孵化成幼鳥的步驟。實驗及效果'在發育神經生物學研究中3H-TDR可用于標記腦中某一時期的新生神經元，也可以在標記后跟蹤這些標記的神經元在后期發育過程中的命運等。為了說明本發明，對胚胎發育至第七天的白腰文鳥卵按照本發明方法注射3H-TDR進行了實驗'研究，并且與同期使用傳統的微量進樣器單卵注射方法注射的鳥卵以及不經注射處理的自然孵化的鳥卵在出殼率和成活率方面進行了比較，結果如表一。實驗中選取適宜注射的健康受精鳥卵及孵化和哺育條件相當的健康親鳥孵化，注射3H-TDR量為5ul/只(luci/ul)，注射位置為大血管旁0.5-lmm，深度2.5mm，處理后立即放回原窩繼續孵化。表一胚胎發育至第七天的白腰文鳥卵注射后發育結果<replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage11</replacetable>從表一可以看出，使用本發明方法處理的鳥卵無論在出殼率還是成活率上均優于使用傳統微量進樣器注射處理的鳥卵，并且與未經注射處理的鳥卵結果相近。因此，本方法是保證較高出殼率和成活率的行之有效的鳥卵定點定量注射方法。應用本發明方法能在生物學及醫學等領域解決傳統的鳥卵注射方法所懸而未決的問題，能大大提高這些領域相關實驗研究的效率。權利要求1、一種向單個鳥卵注射方法，特征在于，其操作步驟如下a、將鳥卵在孵化溫度下定位在預定的朝向位置；b、在卵殼上欲注射位置旁1-2mm處選擇開口位置并用酒精消毒；c、用消毒的實心針在卵殼上的開口位置以及其下的外殼膜、內殼膜上同時制成一個同等大小的小開口，直徑小于2mm。d、輕輕轉動鳥卵使卵內欲注射位置與卵殼上的小開口對準；e、通過小開口伸入一個已消毒的一次性注射針；f、通過一次性注射針向卵中注射物質；g、將卵在低于孵化溫度1-10℃環境下降溫1秒至10秒或小于10分鐘；h、收回一次性注射針；i、使鳥卵在縱切面內轉動5-45°，使注射針道口偏離卵殼上的開口；j、用融化的石蠟封閉開口；k、在孵化溫度下待石蠟凝固；l、將鳥卵放回原處孵化。2、根據權利要求1所說的一種鳥卵注射的方法，特征在于，鳥卵放置于臺式照蛋器的透光孔處，鳥卵的朝向位置是鳥卵的鈍端氣室位于側方或鳥卵的長軸處于水平位置，注射時，注射針不經過氣室進行注射。3、根據權利要求1所說的一種鳥卵注射的方法，特征在于，所說的一次性注射針為用微電極拉制器拉制而成的玻璃微電極。全文摘要一種向單個鳥卵注射方法，其操作步驟如下將鳥卵在孵化溫度下定位在預定的朝向位置；在卵殼上欲注射位置旁選擇開口位置并用酒精消毒；用消毒的實心針在卵殼上的開口位置以及其下的外殼膜、內殼膜上同時制成一個同等大小的小開口；輕輕轉動鳥卵使卵內欲注射位置與卵殼上的小開口對準；通過小開口伸入一個已消毒的一次性注射針；通過一次性注射針向卵中注射物質；將卵在低于孵化溫度1-10℃環境下降溫；收回一次性注射針；使鳥卵在縱切面內轉動角度，使注射針道口偏離卵殼上的開口；用融化的石蠟封閉開口；在孵化溫度下待石蠟凝固；將鳥卵放回原處孵化。優點是成本較低，操作快捷，單卵注射，刺激小、損傷小，無污染，定點、定量注射，直觀。文檔編號A01K67/00GK101341863SQ20081001312公開日2009年1月14日申請日期2008年9月2日優先權日2008年9月2日發明者劉亞龍,利楊,勇馬申請人:渤海大學;劉亞龍