專利名稱：石斛屬的快速繁殖方法
石斛屬的快速繁殖方法所屬領域本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及石斛屬的快 速繁殖方法。
背景技術：
云南省是商品石斛主要產地之一，種類多，資源豐富(全國76種，云南58種，占全國種類的76.3%)。石斛藥材原植物包 含石斛屬植物39種，金石斛屬植物2種和石仙桃屬植物4種。石斛 類植物是常見名貴中藥材(具有滋陰清熱，生津益胃。潤肺止咳。明 目強身等功效)。人們長期無限制，掠奪性和毀滅性的采挖和近年來 大量深層次的研究開發(發現石斛屬許多種還具有抗腫瘤、抗衰老、 增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用)。再加上石斛屬 物種在自然界結實率低，種子因無胚乳，萌發率5%以下。遠不能滿 足目前國內外需求。我國和國際組織(IUCN)都明文規定，石斛屬為 禁止貿易的物種加以保護。現有技術中未見有云南藥用石斛的快速繁 殖方法的報道。發明內容:.本發明的目的在于為石斛屬40種物種提供種苗快速 繁殖方法，為挽救瀕危的石斛類物種，使之成為可再生藥源，為石斛 類GAP種植提供數百萬優良、 一致種苗的技術有參考和實用價值， 是目前保護和持續開發利用石斛類名貴中藥的多、快、好、省的對策。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案石斛屬的快速繁殖方法，取石斛果實內種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中沾一下，然后在酒精燈火焰上燃燒然后用于接種； 莖尖或幼莖在70%乙醇中浸一下，投入0.2%升汞8min，無菌水沖洗 干凈后接種在培養基中，待種子萌發或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進 行繼代培養大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養基上，待芽條 高2-3cm時轉入生根培養基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常， 高度達6cm及以上時，出瓶移栽。具體地，取野外采集或雜交授粉所結的果實，完整的果實在酒精 燈燃燒滅菌后，在無菌條件下將果皮打開，將種子播種在花寶1號 (N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上；而開裂果用尼龍布包裹散落種 子，在0.2MHgcl2中消毒6-8min，無菌水沖洗干凈后播種在花寶1號 (N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上；未成熟的果內種子可播種在花 寶1號3 g丄"+NAAlmg丄"的瓊脂培養基上，培養室溫度25士2。C，光 照強度為1500-2000Lx，光照12h/d，培養基PH為5，培養8-12天種 子由黃色轉綠，呈球形增大，基部有絲狀毛的原球莖，繼代培養在 1/2MS+NAAl+土豆泥3。/。+香蕉泥15%的瓊脂培養基上，30天后，分 化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過1-2個月的培養可得到高約2-3cm 芽條，轉入1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的生根壯苗培養基 培養l個月后加強光照至4000Lx，培養一個月，當試管苗具4-5片仲 展葉，根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系 上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、樹皮、苔蘚和陶粒等， 基質要用20:1的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在蔭 蔽度70%大棚內，棚內溫度控制在2(TC-28'C，注意保濕和排水，7-15 天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新葉后便可定植，依石斛屬種類不同，l-3年均可收護。'具體地，將野外采集到的石斛屬莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在1/2MS+NAAlmg丄"+土豆泥3。/。+香蕉泥15%的瓊脂培養基上， 培養室溫度保持為25±2°C，光照強度為1500-2000Lx，光照12h/d， 培養基PH為5，培養30-60天，腋芽處可抽生新枝，新枝可切割重復 培養，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀，在上述培養基上繼續培養，長成完 整試管苗供移栽；也可接種在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊 脂培養基上，外植體基部可分化出大量擬原球莖，擬原球莖在 1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂培養基上培養30天后， 分化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過1-2個月的培養可得到高2-3cm 芽條，再轉入1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的生根壯苗培養 基培養1個月，此時光照加強至4000Lx，當試管苗具4-5片伸展葉，' 根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系上的瓊 脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、樹皮、苔蘚和陶粒等，基質 要用20:1的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在大棚內 蔭蔽度70%，棚內溫度控制在20。C-28。C，注意保濕和排水，7-15天 用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新葉后，依石斛屬種類 不同，1_3年均可收護。上述方法所涉及的石斛屬種類優選長蘇石斛Dendrobium brymerianum或球花石角斗D. chysiflorum或鼓槌石角斗D.chrysotoxume 或鐵皮石斛D.candidum或金釵石斛雜種選系D.phalaenosis xD.nobile 或短棒石斛D.capillipes或兜唇石斛D.aphyllum或束花石斛 D.chrysanthum或玫瑰石角斗D.crepidatum或疊鞘石角斗D.aurantiacum var.deuneanum或密花石角斗D.densiflorum &11蘇石角斗D.fimbriatum或棒節石斛D.findlayaiium美花石斛D.loddigesii或金釵石斛D.aobile 或長距石角斗D.longicorum或報春石角斗D.primulinum或大複銷石角斗 D.wardianum或霍山石角4 D.huoshanense或齒瓣石角斗D.devonianum 或矮石斛D.bellatulum或串珠石斛D.falooneri或疏花石斛D.henryi 或細莖石斛D.moniliforme或黑毛石斛D.williamsonii或喉紅石斛 D.christyanum 或晶帽石斛 D.crystallimun 或杯鞘石斛 D.gratiotissimum 或小黃花石角斗 D.jenkinsii 或蘇唇石斛 D.harveyanum 或橋L唇石角斗 D.strongylanthum 或尖刀唇石角斗 D,heterocarpum或啤!j叭唇石角斗D.lieniflomm或翅t更石斛D.trigonopiis 或草石斛 D.compactum或秋石斛 D.phalaenosis或石角斗屬一禾中 Dendrobium,sp.或叉唇石角斗D.stuposum或勐海石角斗D.minutiflorum 或腫節石斛D.pendulum。
具體實施例方式下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并 不以此來限定本發明。實施例1: 1材料與方法 1.1供試材料[l]長蘇石角斗Dendrobium brymerianum西雙版納[2]球花石斛D.chysiflorum (2個居群)景洪、昆明[3]鼓槌石斛D.chrysotoxume (4個居群)勐海、保山、思茅、景洪[4]鐵皮石斛D.candidum (9個居群)廣南、思茅、文山(3個居群)浙江、盈江、安寧、小哨 [5]金釵石斛雜種選系D.phalaenosis xD.nobile:6]短棒石斛D.capillipes (2個居群)西雙版納、魯甸 7]兜唇石斛D.aphyllum (2個居群)騰沖、景洪 :8]束花石斛D.chrysanthum (3個居群)麗江、思茅、景洪 :9]玫瑰石斛D.crepidatum文山101疊鞘石角斗D.aurantiacum var.deuneanum (2個居群)昆明、勐海 ll]密花石斛D.densiflorum 12〗流蘇石斛D.fimbriatum (9個居群)緬甸、越南、高黎貢山、西雙 版納等棒節石斛D.fmdlayanum (2個居群)景洪、思茅 美花石斛D.loddigesii金釵石斛D.aobile (8個居群)石屏、景洪(2個居群)、勐臘、 保山、蘭坪、勐海、昆明 長距石角斗D.longicorum 報春石角4 D.primulinum大苞鞘石斛D.wardianum (2個居群)昆明、景洪 霍山石角斗D.huoshanense齒瓣石斛D.devonianum (2個居群)屏邊、景洪 矮石斛D.bellatulum (2個居群)文山、景洪 串珠石斛D.falooneri 疏花石角斗D.henryi細莖石斛D.moniliforme (2個居群)高黎貢山、麗江 黑毛石斛D.williamsonii 喉紅石斛D.christyanum昆明 晶帽石斛D.crystallimun (2個居群)騰沖、景洪[28]杯鞘石斛D.gratiotissimum (3個居群)魯甸、景洪、思茅 [29]小黃花石斛D.jenkinsii (2個居群)文山、景洪 [30]蘇唇石斛D.harveyanum景洪 [31]梳唇石角斗D.strongylanthum[32]尖刀唇石斛D.heterocarpum (3個居群)昆明、景洪、思茅 [33]喇叭唇石斛D.lieniflorum (2個居群)騰沖、鎮康 [34〗翅梗石斛D.trigonopus[35]草石斛D.compactum (2個居群)思茅、騰沖 [36]秋石斛D.phalaenosis (2個居群)泰國、安寧 [37]石斛屬一種Dendrobium.sp.麻栗坡 [38]叉唇石斛D.stuposum [39]勐海石角4 D.minutiflorum [40]腫節石斛D.pendulum 1.2方法培養室溫度25士2。C,保存室溫度15-20°C ，光照強度為 1500-2000Lx，光照12h/d。培養基隨培養目的和不同發育階段有所不 同。培養基PH為5。外植體來源于石斛屬各種的果實內種子或莖尖，果在純乙醇中沾 一下，然后在酒精燈火焰上燒后用于接種。莖尖或幼莖在70%乙醇中 浸一下，投入0.2n/。升汞8min左右，無菌水沖洗干凈后接種。 2結果2.1組織培養和快速繁殖技術在本發明收集保存的石斛屬40個種中，為了保持遺傳性穩定和規 模化生產目的采用了種子無菌培養和莖尖、莖節分生組織培養兩種方式。
2.1.1種子無菌培養
種子來源于野外采集和自己雜交授粉所結的果實。野外采集的開
裂果，收集種子用尼龍布包裹，在0.2MHgcl2中消毒7min，無菌水沖 洗干凈后播種在花寶1號(N:P:K-7:6:19)3gL-1"的瓊脂培養基上。完整 的果實在酒精燈燃燒滅菌后即可將果皮打開將種子播種在上述培養 基上。未成熟的果內種子可播種在花寶1號3 g.L-1"+NAAlmg.L-1 (單 位下同)的瓊脂培養基上。石斛屬種子大多呈黃色，培養約10天左 右即可轉綠，增大，繼而長成頂端有葉尖或冒出的芽，基部有絲狀毛 的原球莖，顯示種子萌發且萌發率較高(達95%以上)。 2丄2分生組織培養
將野外采集到的石斛屬莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在 1/2MS+NAAlmg.L-1"+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂培養基上，培養 30天左右，腋芽處可抽生新枝，新枝可切割重復培養，莖尖抽生新枝 短呈叢芽狀。在此培養基上，它們可長成完整試管苗，供移栽。
如果把莖尖和幼莖接種在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊脂 培養基上，外植體基部可分化出大量擬原球莖。擬原球莖在 1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂培養基上，也可以長成 大苗供移栽。 2丄3繼代繁殖
石斛屬原球莖增殖速度30天至60天(依種量)平均可達1:6-10 倍，由5個人組成的生產車間，年產石斛試管苗可達120萬。
上一步驟原球莖和擬原球莖培養基培養30天左右，可得到 10%lcm小芽和10%0.5cm叢芽，又經過1-2個月的培養可得到高約2-3cm芽條(占50%左右)，轉入生根壯苗培養基(1/2MS+NAAl+土 豆泥3%+香蕉泥15%)培養l個月后加強光照(4000Lx及以上)，培 養一個月左右，試管苗可達到移苗標準。整個生產周期月4.5個月到 6個月。
2丄4試管苗移栽
當試管苗至少4-5片伸展葉根系正常，健康，高度達6cm左右時， 即可出瓶供移栽，出瓶時要小心不能折傷葉片和根尖，清除根系上的 瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、樹皮、苔蘚和陶粒等，基 質要用20:1的水甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒。栽后放在大棚 內蔭蔽度約70%，棚內溫度控制在20°C-28°C，注意保濕和排水。待 試管苗長出新根或新葉后，7-15天用1/10MS液，噴施一次，促進幼 苗生長，和提前收護。依石斛屬種類不同一般l-3年均可收護。
本發明的方法可概括為取野外采集或雜交授粉所結的石斛屬果 實，完整的果實在酒精燈燃燒滅菌后，在無菌條件下將果皮打開，將 種子播種在花寶1號(N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上；而開裂果 用尼龍布包裹散落種子，在0.2y。Hgcl2中消毒6-8min，無菌水沖洗干 凈后播種在花寶1號(N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上；未成熟的 果內種子可播種在花寶1號3 g丄"+NAAlmg丄"的瓊脂培養基上，培 養室溫度25士2。C，光照強度為1500-2000Lx，光照12h/d，培養基PH 為5，培養8-12天種子由黃色轉綠，呈球形增大，基部有絲狀毛的原 球莖，繼代培養在1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂培養 基上，30天后，分化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過l-2個月的培 養可得到高約2-3cm芽條，轉入1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15% 的生根壯苗培養基培養l個月后加強光照至4000Lx，培養一個月，當試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移栽， 出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、樹皮、 苔蘚和陶粒等，基質要用20:1的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消 毒，栽后放在蔭蔽度70%大棚內，棚內溫度控制在20°C-28°C，注意 保濕和排水，7-15天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新 葉后便可定植，依石斛屬種類不同，l-3年均可收護。
本發明的方法可概括為將野外采集到的石斛屬莖尖或帶腋芽的 幼莖切段滅菌后接種在1/2MS+NAAlmg丄"+土豆泥3%+香蕉泥15% 的瓊脂培養基上，培養室溫度保持為25±2°C，光照強度為 1500-2000Lx，光照12h/d，培養基PH為5，培養30-60天，腋芽處可 抽生新枝，新枝可切割重復培養，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀，在上述 培養基上繼續培養，長成完整試管苗供移栽；也可接種在1/2MS或 1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊脂培養基上，外植體基部可分化出大量擬 原球莖，擬原球莖在1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂培 養基上培養30天后，分化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過1-2個 月的培養可得到高2-3cm芽條，再轉入1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香 蕉泥15%的生根壯苗培養基培養1個月，此時光照加強至4000Lx，當 試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移栽， 出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、樹皮.、 苔蘚和陶粒等，基質要用20:1的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消 毒，栽后放在大棚內蔭蔽度70%，棚內溫度控制在20°C-28°C，注意 保濕和排水，7-15天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新 葉后，依石斛屬種類不同，l-3年均可收護。
權利要求
1、石斛屬的快速繁殖方法，其特征在于取石斛果實內種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中沾一下，然后在酒精燈火焰上燃燒然后用于接種；莖尖或幼莖在70％乙醇中浸一下，投入0.2％升汞8min，無菌水沖洗干凈后接種在培養基中，待種子萌發或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進行繼代培養大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養基上，待芽條高2-3cm時轉入生根培養基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm及以上時，出瓶移栽。
2、 如權利要求1所述的方法，其特征在于取野外采集或雜交授粉 所結的果實，完整的果實在酒精燈燃燒滅菌后，在無菌條件下將果皮 打開，將種子播種在花寶1號(N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上； 開裂果，用尼龍布包裹散落種子，在0.2MHgcl2中消毒6-8min，無菌 水沖洗干凈后播種在花寶1號(N:P:K-7:6:19)3g丄"的瓊脂培養基上； 未成熟的果內種子可播種在花寶1號3 g丄"+NAAlmg丄'1的瓊脂培養 基上，培養室溫度25士2。C，光照強度為1500-2000Lx，光照12h/d， 培養基PH為5，培養8-12天種子由黃色轉綠，呈球形增大，基部有 絲狀毛的原球莖，繼代培養在1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15% 的瓊脂培養基上，30天后，分化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過 1-2個月的培養可得到高約2-3cm芽條，轉入1/2MS+NAAl+土豆泥 3%+香蕉泥15%的生根壯苗培養基培養1個月后加強光照至4000Lx， 培養一個月，當試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植 基質有鋸末、樹皮、苔蘚和陶粒等，基質要用20:1的水:甲醛密封消 毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在蔭蔽度70%大棚內，棚內溫度控制 在20。C-28。C，注意保濕和排水，7-15天用1/10MS液噴施一次，待試 管苗長出新根或新葉后便可定植，依石斛屬種類不同，1-3年均可收 護。
3、如權利要求1所述的方法，其特征在于將野外采集到的石斛屬 莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在1/2MS+NAAlmg丄"+土豆泥 3%+香蕉泥15%的瓊脂培養基上，培養室溫度保持為25士2'C，光照強 度為1500-2000Lx，光照12h/d，培養基PH為5，培養30-60天，腋 芽處可抽生新枝，新枝可切割重復培養，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀， 在上述培養基上繼續培養，長成完整試管苗供移栽;也可接種在1/2MS 或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊脂培養基上，外植體基部可分化出大量 擬原球莖，擬原球莖在1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的瓊脂 培養基上培養30天后，分化出lcm小芽和0.5cm叢芽，又經過1-2 個月的培養可得到高2-3cm芽條，再轉入1/2MS+NAAl+土豆泥3%+ 香蕉泥15%的生根壯苗培養基培養1個月，此時光照加強至4000Lx， 當試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm時，即可出瓶供移 栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質有鋸末、 樹皮、苔蘚和陶粒等，基質要用20:1的水:甲醛密封消毒24h或用熱 蒸汽消毒，栽后放在大棚內蔭蔽度70%，棚內溫度控制在2(TC-28'C， 注意保濕和排水，7-15天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根 或新葉后，依石斛屬種類不同，l-3年均可收護。4、如權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述石斛種 類優選長蘇石角斗Dendrobium brymerianum或球花石角斗D. chysiflorum 或鼓槌石斛D.chrysotoxume或鐵皮石斛D.candidum或金釵石斛雜 種選系D.phalaenosis xD.nobile或短棒石斛D.capillipes或兜唇石斛 D.aphyllum或束花石角斗D.chrysanthum或玫瑰石角斗D.crepidatum或 疊鞘石角斗D.aurantiacum var.deuneanum或密花石斛D.densiflorum流 蘇石斛 D.fimbriatum或棒節石斛 D.fmdlayanum美花石斛 D.loddigesii或金釵石斛D.aobile或長距石斛D.longicorum或報春 石斛 D.primulinum或大苞鞘石斛 D.wardianum或霍山石斛 D.huoshanense或齒瓣石角斗D.devonianum或矮石斛D.bellatulum或 串珠石斛 D.falooneri或疏花石斛 D.henryi或細莖石斛 D.moniliforme或黑毛石角斗D.williamsonii或喉紅石角斗D.christyanum 或晶帽石角斗D.crystallimun或杯鞘石角斗D.gratiotissimum或小黃花石 角斗 D.jenkinsii 或蘇唇石角斗 D.harveyanum 或*荒唇石角斗 D.strongylanthum或尖刀唇石斛 D.heterocatpum或喇叭唇石角斗 D.lieniflorum或翅梗石角斗D.trigonopus或草石斛D.compactum或秋 石角斗 D.phalaenosis或石角斗屬——種 Dendrobium.sp. 或叉唇石角斗 D.stuposum或動海石角斗D.minutiflorum或月中節石角斗D.pendulum。
全文摘要
石斛屬的快速繁殖方法，取石斛果實內種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中沾一下，然后在酒精燈火焰上燃燒然后用于接種；莖尖或幼莖在70％乙醇中浸一下，投入0.2％升汞8min，無菌水沖洗干凈后接種在培養基中，待種子萌發或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進行繼代培養大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養基上，待芽條高2-3cm時轉入生根培養基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達6cm及以上時，出瓶移栽。
文檔編號A01H4/00GK101213940SQ20081005804
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月18日 優先權日2008年1月18日
發明者程治英, 羅吉鳳, 龍春林 申請人:中國科學院昆明植物研究所