專利名稱：：一種合成寡肽及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于農業
技術領域：
，本發明涉及模擬谷胱甘肽結構，合成的新的具有抗氧化活性的寡肽，本發明還涉及這些寡肽物質的體外抗氧化效應、提高細胞抗氧化能力以及提高小麥幼苗的抗熱性。
背景技術：
：生物體在正常生理條件下，體內活性氧自由基(ROS)的產生和清除相對均衡，而在遭受各種生物和非生物逆境脅迫時，體內的ROS的產生和清除平衡遭到破壞(王豐等，高等學校化學學報，2007，28:10711076),造成氧負離子GO2-)和過氧化氬(H202)等ROS的大量積累，引發蛋白質、核酸和脂類的氧化損傷。谷胱甘肽(GSH)是植物體內一種非常重要的抗氧化肽，參與植物對多種逆境的抵抗過程。它能夠直接和間接地清除ROS，使細胞免受ROS以及各種有害物質的毒害，具有抵抗逆境和解毒的作用，已被廣泛用于醫療保健方面(陳坤明等，西北植物學報，2004,24:11191130)。有研究表明，外源施加GSH能夠提高逆境脅迫下植物內源抗氧化酶的活性和抗氧化物物質的水平，降低丙二醛(MDA)的含量，保護植物免受活性氧的傷害(劉傳平等，南京農業大學學報,2004，27:2630)。但是由于植物體內存在GSH的代謝途徑，效應濃度和成本較高，目前尚難在農業生產中大面積應用。在逆境脅迫條件下，植物體內還會積累一些與抗逆相關的氨基酸，如脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、Y-氨基丁酸(GABA)等，它們有些可以作為滲透調解物質，有些可以作為信號物質，參與植物抵抗逆境的過程。也有報道表明，在外源施加某些氨基酸時，也能夠提高植物對逆境脅迫的抵抗能力(賀巖等，大豆科學，2000,19(4):314~319;王寶山等，植物生理學通訊，1993,29(3):182184;高洪波等，植物生理與分子生物學學報，2004,30(6):651~659;田小磊等，實驗生物學報，2005,38(1):75~79)。本發明通過模擬GSH的結構，將一些與逆境相關的氨基酸重新組合，合成新的具有抗氧化活性寡肽。本發明對于現有的發明專利具有兩點明確的優勢其一，相對于植物生長調節劑來說，合成的寡肽來源的氨基酸均為生物體內天然存在的氨基酸，對人體不存在任何毒性，處理作物后不存在殘毒殘效；其二，相對于GSH外源施加，合成的寡肽物質不是植物體內本身存在的物質，因此不易被植物所專一的降解，能在極低的使用濃度發揮高效的生物活性，能超過GSH的抵抗逆境功能。模擬GSH的結構，將一些與逆境相關的氨基酸重新組合，合成一些新的寡肽可能也具有抗氧化活性，而且由于是非天然物質而不易被植物所專一的降解。有關人工合成GSH類似物的抗氧活性的研究未見報道。
發明內容本發明的目的是提供新的寡肽物質，能有效緩解逆境脅迫對細胞的抑制生長，增強細胞抵抗逆境脅迫的能力。本發明人充分研究谷胱甘肽與其它氨基酸的抵抗逆境性能，模擬谷胱甘肽結構合成類似寡肽，完成了本發明。本發明提供的寡肽含有三個氨基酸，序列中間為半胱氨酸，一端為谷氨酸或甘氨酸，另一端為具有抗逆作用的其他氨基酸脯氨酸或y-氨基丁酸。本發明的合成寡肽包括但不限于谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸(Glu-Cys-GABA)、y-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸(GABA-Cys-Glu)、脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸(Pro-Cys-Gly)以及甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸(Gly-Cys-Pro)。實驗表明，本發明提供的合成寡肽其對DPPH的體外清除率顯著高于游離氨基酸的組合，也顯著高于谷胱甘肽本身，其中谷氨酰-半胱氨酰-，氨基丁酸(Glu-Cys-GABA)對DPPH的體外清除效果尤其好。在本發明的一個實施例中，合成寡肽提高了鹽脅迫下魚腥藻7120細胞抗氧化能力；另一個實施例中，合成寡肽提高了鹽脅迫下煙草BY-2細胞的抗氧化能力；另一個實施例中，合成寡肽提高了鹽脅迫下煙草BY-2細胞系抗氧化酶活性；再一個實施例中，合成寡肽提高了小麥幼苗的抗熱性。由此可見，由于合成寡肽具有清除自由基和抗逆的作用，其能提高在鹽脅迫下植物細胞的抗氧化能力和氧化酶活性。本發明的優點在于(l)發明制備了未見報道的具有增強植物細胞和幼苗在鹽脅迫和高溫脅迫條件下抗氧化能力的寡肽；(2)發明制備的寡肽較其它常規的植物生長調節劑有更高的安全性和生理效應；(3)發明制備的寡肽生理活性高效、穩定，有理論支持(GSH結構類似物)；相對與GSH而言，又不容易被植物所代謝降解，提高了其在植物體內的穩定性和高效活性；(4)發明制備的寡肽結合了一些與逆境相關的氨基酸，如脯氨酸(Pro)、Y-氨基丁酸(GABA)等，發明的新寡肽比GSH有更高的生物活性。圖i是寡肽谷氨酰-半胱氨酰卞氨基丁酸的質譜圖2是寡肽谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸高效液相色譜圖。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1:寡肽谷氨酰-半胱氨酰個氨基丁酸的制備稱取2克2-氯三苯甲基氯樹脂，加入20亳升N-甲基吡咯烷酮溶脹樹脂2小時后排凈液體；加入二氯甲烷20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-芴甲氧羰基，氨基丁酸，用5亳升N-甲基吡咯垸酮溶解并轉移至反應器，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15亳升N-甲基吡咯烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次。加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20毫升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-芴甲氧羰基半胱氨酸，用5亳升N-甲基吡咯烷酮溶解，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15亳升N-甲基吡咯烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次。取樣檢測。加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-荀甲氧羰基谷氨酸，用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15亳升N-甲基吡咯烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20毫升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次。取樣加入20%六氫吡啶20毫升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次。加入切割液三氟乙酸，反應4小時，過沙芯漏斗過濾，收集濾液，用冰乙醚離心沉淀，凍干即得目標寡肽產物。產物用質譜和高效液相色譜進行確證與含量測定。合成寡肽的質譜和液相色譜檢測圖譜見附圖1和附圖2。質譜分析數據表明所合成產物即為目標寡肽谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸，實測合成產物分子量為334.43(M+H+),與理論值分子量333.39接近。高效液相色譜的分析數據表明，合成寡肽的純度為99.36%。寡肽r氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸的制備步驟與上述谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸的步驟類似。產物經上述液相色譜和質譜分析驗證為目標寡肽。寡肽甘氨酰-半胱氨酰-谷氨酸、寡肽谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸的制備步驟與上述谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸、y-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸的步驟類似。產物經上述液相色譜和質譜分析驗證為目標寡實施例2:寡肽脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸(Pro-Cys-Gly)的制備稱取2克2-氯三苯甲基氯樹脂，加入20亳升N-甲基吡咯烷酮溶脹樹脂2小時后排凈液體；加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-芴甲氧羰基甘氨酸，用5亳升N-甲基吡咯烷酮溶解并轉移至反應器，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次。取樣檢測。加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-芴甲氧羰基半胱氨酸，用5亳升N-甲基吡咯烷酮溶解，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15亳升N-甲基吡咯烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次。取樣檢測。加入20%六氫吡啶20毫升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20亳升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20毫升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次；稱取2克9-芴甲氧羰基脯氨酸，用5亳升N-甲基吡咯烷酮溶解，加入40微升3M的二異丙基乙胺，混勻后加入反應器，再加入15亳升N-甲基吡唂烷酮反應2小時。清空反應器，加入二氯甲烷20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻l分鐘，清空反應器，重復2次。取樣加入20%六氫吡啶20毫升，反應30分鐘后清空反應器，再加入20%六氫吡啶20毫升，反應30分鐘后清空，加入二氯甲烷20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，再加入N-甲基吡咯烷酮20亳升，混勻1分鐘，清空反應器，重復2次。加入切割液三氟乙酸，反應4小時，過沙芯漏斗過濾，收集濾液，用冰乙醚離心沉淀，凍干即得目標寡肽產物。產物用質譜和高效液相色譜進行確證與純度測定(方法同谷氨酰-半胱氨酰-Y-氨基丁酸)。寡肽甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸的制備步驟與上述脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸的步驟類似。產物經上述液相色譜和質譜分析驗證為目標寡肽。寡肽脯氨酸-半胱氨酰-Y-氨基丁酸、寡肽Y-氨基丁酰-半胱氨酰-脯氨酸的制備步驟與上述脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸、甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸的步驟類似。產物經上述液相色譜和質譜分析驗證為目標寡實施例3:合成寡肽對離體條件下自由基的清除1、實驗方法寡肽對離體條件下自由基的清除通過對l，l-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的清除率進行評價將寡肽配置成0.2mmol/L溶液，與DPPH乙醇溶液混合反應30分鐘，用CARY100紫外可見分光光度計(CARY100BioUV-visiblespectrophotometer,美國VARIAN公司生產)在517nm波長下測定吸光值，以乙酸緩沖液作為空白，以GSH作為陽性對照。寡肽對DPPH的體外清除率用以下公式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>空白吸光值各樣品重復5次，取平均值。2、實驗結果八種合成寡肽對有機自由基DPPH的體外清除率優于陽性對照GSH;合成寡肽的組成氨基酸組合施用以及氨基酸Cys也具有體外清除DPPH的作用，但顯著低于合成寡肽與陽性對照GSH。表1合成寡肽對DPPH的體外清除<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4:合成寡肽提高鹽脅迫下魚腥藻7120細胞抗氧化能力1、實驗方法用BG-11培養基，2%魚腥藻7120(購自華中農業大學)接種于50mL三角瓶中，25。C光照靜置培養并定時搖動。繼代時用0.2mmol/L的合成寡肽進行處理；培養2天后用100mmol/LNaCl處理，3天后進行取樣測定細胞生長量、細胞提取液對DPPH的清除率以及細胞內氧負離子002-)的產生速率和過氧化氫(H202)的含量。細胞生長量用OD75o表示，用CARYIOO紫外可見分光光度計(CARY100BioUV-visiblespectrophotometer,美國VARIAN公司生產)測定。.O2-和H202測定按照VermaS.和MishraS.N.的方法(JouumalofPlantPhysiology,2005年，162卷，669-677頁)。以GSH作為陽性對照。各樣品作5個平行重復，取平均值。2、實驗結果鹽脅迫顯著抑制了魚腥藻的生長，降低了細胞的抗氧化水平；鹽脅迫下八種合成寡肽處理均促進了魚腥藻的生長，對DPPH的清除率顯著提高，而'02—的產生速率和11202的含量均明顯降低。結果表明，八種合成多肽顯著提高鹽脅迫下魚腥藻7120的抗氧化能力。_表2合成寡肽對魚腥藻7120抗氧化能力的影響_細胞生長細胞提取液.02—的產生速率H202的含量處理i(OD75o)對DPPH清除(nmol'^FW'h-1)Oimol'g"FW)率(％)對照0.22826.017.43.84NaCl脅迫0.15818.933.45.79NaCl+GSH0.21325.822.94.57NaC+Glu-Cys-GABA0.17726,325.74.86NaCl+GABA-Cys-Glu0.19525.123,34.72NaCl+Pro-Cys-Gly0.18824.421.84.51NaCl+Gly-Cys-Pro0.20424,922.64.63NaCl+Glu-Cys曙Gly0.19624.823.04.65NaCl+Gly-Cys-Glu0.18024.623.24.60NaCl+Pro-Cys-GABA0.21025.021,54.55NaCl+GABA-Cys-Pro0,20625.222.04.50實施例5:合成寡肽提高鹽脅迫下煙草BY-2細胞的抗氧化能力1、實驗方法用改良的LS培養基，5。/。煙草BY-2細胞(購自中國農業大學植物生理與生物化學國家重點實驗室)接種于50mL三角瓶中，27°C130rmin"避光震蕩培養。繼代時用0.2mmol/L的合成寡肽進行處理；培養2天后用100mmol/LNaCl處理，3天后進行取樣測定細胞鮮重、細胞提取液對DPPH的清除率以及細胞內氧負離子('02。的產生速率和過氧化氫(H202)的含量。O2-和&02測定按照VermaS.和MishraS.N.的方法(JouumalofPlantPhysiology,2005年，162卷,669-677頁)。以GSH作為陽性對照。各樣品作5個平行重復，取平均值。2、實驗結果鹽處理明顯抑制了煙草細胞的生長，降低了細胞的抗氧化水平。鹽脅迫下八種合成寡肽處理煙草細胞，其鮮重提高30%以上，細胞提取液對DPPH的清除率提高23%以上，'02-的產生速率和H202的含量也顯著降低。結果表明，合成多肽能顯著的提高鹽脅迫下煙草BY-2細胞的抗氧化能力。_表3合成寡肽對煙草BY-2細胞抗氧化能力的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例6:合成寡肽提高鹽脅迫下煙草BY-2細胞系抗氧化酶活性1、實驗方法供試材料與培養、處理方法同實施例4。收集煙草細胞，加入50mmolU1pH=7.0磷酸緩沖液，在冰洛上研磨提取，12,000g離心15min,取上清液備用。測定SOD、CAT和POD的活性。.0"則定按照VermaS.和MishraS.N.的方法(JouumalofPlantPhysiology,2005年，162卷，669-677頁)。SOD、POD、CAT活性測定方法和具體操作見鄒琦等主編的植物生理學實驗指導(中國農業出版社，2000年)。2、實驗結果鹽脅迫明顯提高了煙草細胞的SOD活性，而POD和CAT的活性則降低。鹽脅迫下八種寡肽處理的煙草細胞SOD和POD的活性顯著提高，使細胞的抗氧化能力提高。表4合成寡肽對煙草BY-2細胞抗氧化酶活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例7:合成寡肽提髙小麥幼苗的抗熱性1、實驗方法供試小麥品種為京都40，購自中國農業科學院國家農作物種質保存中心，將表面消毒的種子培養于裝有蛭石花土為1:1的塑料花盆(長x寬x高=8cmx8cmx10cm)中，25。C下培養。當小麥苗齡7天時，用0.2mmol/L的合成寡肽對小麥葉片進行涂抹處理，以GSH作為陽性對照。兩天后進行高溫脅迫處理，白天(14小時，光強5000Lux)40。C/晚上(10小時)30°C。48小時后取樣，測定小麥葉片-02-產生速率和抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性。.02-測定按照VermaS.和MishraS.N.的方法(JouumalofPlantPhysiology,2005年,162卷，669-677頁)。SOD、POD、CAT活性測定方法和具休操作見鄒琦等主編的植物生理學實驗指導(中國農業出版社，2000年)。2、實驗結果高溫脅迫使小麥葉片中02-的產生速率顯著加快。八種寡肽處理均顯著的降低了高溫脅迫下小麥葉片中<^的產生速率，效果與GSH相當。八種合成寡肽處理提高了高溫脅迫下SOD、POD和CAT的活性，增強了小麥幼苗在高溫脅迫下的抗氧化能力。表5合成寡肽對高溫脅迫下小麥葉片氧自由基產生速率和抗氧化酶活性的影響-02-的產生速率SODPODCAT處理(nmol.g-'FW'h")(U.g-'FW)(U.g-1FW)(U-g-lFW)對照127.7110.3436.427.4NaCl脅迫240.1150.9442.1,19.9NaCl+GSH202.4168.4542.945.6NaCl+Glu-Cys-GABA196.4165.4499.337.4NaCl+GABA-Cys-Glu203.9158.3483.236.9NaCl+Pro-Cys-Gly214.1154,8476.738.6NaCl+Gly-Cys-Pro208.6157,0494.834.5NaCl+Glu-Cys-Gly206.5150.0486.536.8NaCl+Gly-Cys-Glu210.2154.5490.239.5NaCl+Pro-Cys-GABA192.5165.0518.539.1NaCl+GABA-Cys-Pro200.0158.2520.038,權利要求1、一種合成寡肽，其含有三個氨基酸，該寡肽序列中間為半胱氨酸，一端為谷氨酸或甘氨酸，另一端為脯氨酸或γ-氨基丁酸。2、根據權利要求l所述寡肽，其氨基酸序列為谷氨酰-半胱氨酰-，氨基丁酸、Y-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸、脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸或甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸。3、含有權利要求1或2所述合成寡肽的植物生長調節劑。4、權利要求1或2所述寡肽在離體條件下清除活性氧自由基DPPH中的應用。5、權利要求1或2所述寡肽在提高鹽脅迫下植物細胞的抗氧化能力和/或活性氧清除酶活性中的應用。6、如權利要求5所述的應用，其中所述植物為魚腥藻或煙草。7、權利要求l或2所述寡肽在提高小麥幼苗抗熱性中的應用。全文摘要本發明涉及一種含有三個氨基酸的合成寡肽，其序列中間為半胱氨酸，一端為谷氨酸或甘氨酸，另一端為具有抗逆作用的氨基酸脯氨酸或γ-氨基丁酸，其功能與谷胱甘肽類似，能夠在離體條件下清除1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基，提高鹽脅迫下魚腥藻和煙草細胞的抗氧化能力和氧化酶活性，提高小麥幼苗的抗熱性。文檔編號A01N63/00GK101434645SQ20081024095公開日2009年5月20日申請日期2008年12月24日優先權日2008年12月24日發明者張明才,李召虎,李建民,段留生,田曉莉,虹祁,翟志席,董學會,譚偉明申請人:中國農業大學