專利名稱：螨過(guò)敏原之變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于家塵螨Der ρ 2過(guò)敏原之新穎變體及其用途。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)久以來(lái)，已知家塵螨系諸多疾病之肇因，諸如，氣喘、鼻炎、鼻竇炎、濕疹、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏、結(jié)膜炎、及/或血管性水腫(Sporik R，Chapman MD, Platts-Mills ΤΑ. House dust mite exposure as a cause of asthma. Clin Exp Allergy 1992 ；22 (10) 897-906.) ο 特定言之，歐洲塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是一種主要的家塵螨，且已進(jìn)行了許多研究辨識(shí)其所產(chǎn)生之過(guò)敏原。于此，Der ρ 2已被認(rèn)定為歐洲塵螨所產(chǎn)生的代表性過(guò)敏原。超過(guò)80%之過(guò)敏病患皆會(huì)與Der ρ 2產(chǎn)生反應(yīng)(Lind P， Lowenstein H. Identification of allergens in Dermatophagoides pteronyssinus mite body extract by crossed radioImmunoelectrophoresis with two different rabbit antibody pools. Scand J Immunol 1983 ； 17 (3) :263-73 ；Heymann PW, Chapman MD, Aalberse RC, Fox JW, Platts-Mills TA. Antigenic and structural analysis of group II allergens(Der f II and Der ρ II)from house dust mites (Dermatophagoides spp). J Allergy Clin Immunol 1989 ；83 (6) :1055-67.)。Der ρ 2在天然環(huán)境下具有長(zhǎng)期安定性(de Boer R，van der Hoeven WA, Stapel SO. The decay of house dust mite allergens, Der ρ I and Der ρ II， under natural conditions. Clin Exp Allergy 1995 ；25 (8) :765-70.)，且其對(duì)熱、 pH、及各種化學(xué)變性處理皆具有抗性(Lombardero M，Heymann PW，Platts-Mills TA， Fox JW, Chapman MD. Conformational stability of B cell epitopes on group I and group II Dermatophagoides spp.allergens. Effect of thermal and chemical denaturation on the binding of murine IgG and human IgE antibodies. J Immunol 1990 ； 144(4) :1353-60. )。Der ρ 2 之三維結(jié)構(gòu)已由 NMR(Mueller GA，Benjamin DC， Rule GS. Tertiary structure of the major house dust mite allergen Der ρ 2 sequential and structural homologies. Biochemistry 1998 ；37 (37) :12707-14.)及 X 光結(jié)晶學(xué)(Derewenda U，Li J，Derewenda Z，Dauter Z，Mueller GA, Rule GS et al· The crystal structure of a major dust mite allergen Der ρ 2，and its biological implications. J Mol Biol 2002 ；318(1) :189-97.)判定。特定言之，Der ρ 2 具有免疫球蛋白(Ig)折疊結(jié)構(gòu)，含兩個(gè)反平行β片層。此外，Der ρ 2缺乏可連接Ig樣結(jié)構(gòu)域中的 B鏈及F鏈之間的片層間二硫鍵；而是在殘基8與119、殘基21與27、以及殘基73與78之間存在有三個(gè)二硫鍵。此在，殘基8與119之間的二硫鍵使A'鏈及G'鏈彼此連結(jié)，而另外兩個(gè)二硫鍵則是位在環(huán)區(qū)域。Der ρ 2之cDNA序列已完成鑒定，而其推導(dǎo)出來(lái)的氨基酸序列顯示Der ρ 2具有 146個(gè)氨基酸殘基，并具有一段含17個(gè)殘基的信號(hào)肽。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Der ρ 2之DNA序列中存在大量的多型性(Chua KY，Huang CH，Shen HD，Thomas WR. Analysis of sequencepolymorphism of a major mite allergen, Der ρ 2. Clin Exp Allergy 1996 ；26 (7) 829-37 ；Smith WA, Hales BJ, Jarnicki AG, Thomas WR. Allergens of wild house dust mites !environmental Der ρ land Der ρ 2sequence polymorphisms. J Allergy Clin Immunol 2001 ; 107 (6) :985-92.)。目前為止，已鑒別出八種Der ρ 2變體，其在所述多型性殘基處各自具有獨(dú)特的氨基酸取代(Hales BJ, Hazell LA, Smith W, Thomas WR. Genetic variation of Der ρ 2allergens :effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy 2002 ；32 (10) :1461-7.)。此等變體可用于研究塵螨過(guò)敏之免疫發(fā)病機(jī)制，以及研發(fā)用以診斷及治療塵螨過(guò)敏之試劑。

發(fā)明內(nèi)容
我們藉由篩選歐洲塵螨λ gtIlcDNA庫(kù)，分離出新穎過(guò)敏原「Der ρ 2變體Τ」之 cDNA。在此，本發(fā)明鑒定出Der ρ 2變體T cDNA之核苷酸序列，且在大腸桿菌(E. coli)及畢氏酵母(Pichia pastoris)中制造重組Der ρ 2變體T多肽。Der ρ 2變體T可用于疾病之診斷及治療。在第一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種聚核苷酸，其系由編碼氨基酸序列SEQ ID Ν0:1之核苷酸序列構(gòu)成。在第二態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID Ν0:1之核苷酸序列。在第三態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因生物，其包含上述之聚核苷酸或重組核酸。在第四態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。在第五態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種診斷個(gè)體對(duì)家塵螨之過(guò)敏的方法，其包含檢測(cè)該個(gè)體是否會(huì)與上述多肽產(chǎn)生反應(yīng)。在第六態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種診斷個(gè)體對(duì)家塵螨之過(guò)敏的組合物，其包含上述多肽以及稀釋劑。在本發(fā)明之第七態(tài)樣中，其提供一種治療或預(yù)防個(gè)體之過(guò)敏性疾病的方法，其包含對(duì)該個(gè)體投與上述多肽。在第八態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，其包含上述多肽以及醫(yī)藥可接受之賦形劑或載體。在第九態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種DNA疫苗，其包含上述聚核苷酸或重組核酸。


前述的發(fā)明內(nèi)容以及前述的實(shí)施方式，可在結(jié)合附呈的圖式閱讀時(shí)更為明了。就說(shuō)明本發(fā)明之目的而言，圖式顯示的是目前較佳的具體實(shí)例。然而，應(yīng)明了的是，本發(fā)明并不限于所示的較佳具體實(shí)例。在附圖中圖1表示本發(fā)明Der ρ 2變體T之cDNA核苷酸序列以及其推導(dǎo)氨基酸序列。圖2表示Der ρ 2. 0101之cDNA分子的核苷酸序列(登錄號(hào)AF276239)以及其推導(dǎo)氨基酸序列(登錄號(hào)P49278)。圖3顯示Der ρ 2變體T與Der ρ 2. 0101之核苷酸序列間的排列比較，其中在核苷酸序列之上方及下方所指出的氨基酸殘基分別為Der ρ 2變體T及Der ρ 2. 0101之獨(dú)特氨基酸取代；起始及終止密碼子畫(huà)有底線；符號(hào)“ · ”表示相同的核苷酸；符號(hào)“_”表示間隔；而陰影部分則表示3’未翻譯核苷酸序列。圖4顯示SDS-PAGE分析之結(jié)果，其中第1道代表取自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)之 GST-Der ρ 2. 0101融合蛋白；第2道代表取自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)之GST-Der ρ 2變體T融合蛋白；第3道代表取自畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)之GST-Der ρ 2. 0101蛋白；第4道代表取自畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)之GST-Der ρ 2變體T蛋白；而M代表分子量標(biāo)記物。圖5系關(guān)于IgE點(diǎn)漬免疫分析，其中(A)顯示加在硝基纖維素膜上的蛋白樣本之位置，包括GST-Der ρ 2. 0101融合蛋白、GST-Der ρ 2變體T融合蛋白、GST肽、及歐洲塵螨萃取物；(B)顯示免疫分析之結(jié)果，編號(hào)1至50各自表示取自所述50名病患之血清樣本； 以及(C)顯示由光密度計(jì)所定量的蛋白樣本IgE反應(yīng)性程度。
具體實(shí)施例方式除非另外定義，本文中所用之所有技術(shù)及科學(xué)詞匯具有所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常明了之相同意義。在本文中，除非另有明示，下列之術(shù)語(yǔ)具有其所述意義。在本文中，冠詞「一」系指一個(gè)或一個(gè)以上(亦即，至少一個(gè))該冠詞在文法上之受詞。舉例而言，「一組件」意謂一個(gè)組件或一個(gè)以上之組件。術(shù)語(yǔ)「聚核苷酸」或「核酸」系指由核苷酸單元所構(gòu)成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，諸如，脫氧核糖核酸(「DNA」)或核糖核酸(「RNA」)，以及核酸類似物，包括具有非天然存在之核苷酸者。聚核苷酸可由合成產(chǎn)生，例如，使用自動(dòng)化DNA合成儀。術(shù)語(yǔ) 「核酸」一般而言系指大型聚核苷酸。應(yīng)明了的是，當(dāng)一核苷酸序列系由DNA序列表示(亦即，A、T、G、C)，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中以「U」取代「Τ」。術(shù)語(yǔ)「cDNA」 系指與mRNA互補(bǔ)或相同之DNA，其可為單股或雙股形式。術(shù)語(yǔ)「互補(bǔ)」系指兩聚核苷酸交互作用表面有拓?fù)浼嫒菪曰蛳嗷ヅ鋵?duì)。因此，該兩分子可被視為互補(bǔ)，兩者的接觸表面特征彼此互補(bǔ)。如第一聚核苷酸的核苷酸序列與第二聚核苷酸之聚核苷酸結(jié)合配對(duì)物的核苷酸序列相同，則可稱為第一聚核苷酸與第二聚核苷酸互補(bǔ)。因此，序列為5' -TATAC-3'之聚核苷酸系與序列為5' -GTATA-3'之聚核苷酸互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)「編碼」系指聚核苷酸(如，基因、cDNA、或mRNA)中之特定核苷酸序列的固有特性，其可在在生物作用中作為模板，以合成其他具有指定核苷酸序列(亦即，rRNA、tRNA、 及mRNA)或指定氨基酸序列以及其由其所產(chǎn)生之生物特性的聚合物或巨分子。因此，如由一基因所產(chǎn)生之mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯可在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生一蛋白，則稱該基因編碼該蛋白。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可明了的是，由于遺傳密碼之簡(jiǎn)并性，不同的聚核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。亦可明了的是，使用常規(guī)技術(shù)，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可制造出核苷酸取代，其不影響本文所述聚核苷酸所編碼之多肽序列，而反映出用以表達(dá)該等多肽之任何特定宿主生物的密碼子使用偏好。因此，除非另有明示，「編碼一氨基酸序列之核苷酸序列」包括所有互為彼此簡(jiǎn)并版本且編碼相同氨基酸序列之核苷酸序列。編碼蛋白及RNA之核苷酸序列可包括內(nèi)含子。術(shù)語(yǔ)「重組核酸」系指具有非天然彼此連結(jié)之序列的聚核苷酸或核酸。重組核酸可以載體之形式存在。「載體」可含有想要的指定核苷酸序列以及調(diào)控序列。載體可用于表達(dá)該指定核苷酸序列或是維持該指定核苷酸序列以進(jìn)行復(fù)制、操縱、或在不同位置間傳輸 (如，在不同之生物間)。可將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以進(jìn)行上述目的。載體之實(shí)例包括，但不限于，質(zhì)粒、粘粒(cosmid)、噬菌體、YACs或PACs。一般而言，在載體中，指定的核苷酸序列是以可操作之方式與調(diào)控序列連結(jié)，因而使得載體在被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，指定核苷酸序列可受調(diào)控序列之控制而在宿主細(xì)胞中表達(dá)。調(diào)控序列可包含，例如但并不限于，啟動(dòng)子序列(如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、猴病毒40(SV40)早期啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、及醇氧化酶基因(AOXl)啟動(dòng)子)、起始密碼子、復(fù)制起點(diǎn)、增強(qiáng)子、操作子序列、分泌信號(hào)序列(如，α-交配因子信號(hào))、以及其他控制序列(如，Shine-Dalgarno 序列及終止序列)。較佳者，載體可進(jìn)一步包含標(biāo)記序列(如，抗生素抗性標(biāo)記序列)，以進(jìn)行后續(xù)之篩選流程。更佳者，在載體中，指定的核苷酸序列可與另一非上述調(diào)控序列之核苷酸序列連結(jié)，以產(chǎn)生一融合多肽，其有利于后續(xù)之純化流程。融合多肽包括，但不限于，融合 His-標(biāo)簽之多肽，以及融合GST之多肽。術(shù)語(yǔ)「多肽」系指由經(jīng)肽鍵連結(jié)之氨基酸殘基所構(gòu)成的聚合物。多肽可由合成產(chǎn)生，例如，使用自動(dòng)化多肽合成儀。術(shù)語(yǔ)「蛋白」一般而言系指大型之多肽。術(shù)語(yǔ)「肽」一般而言系指短型之多肽。氨基酸可由三個(gè)字母或一個(gè)字母表示。表1列述標(biāo)準(zhǔn)之氨基酸縮寫(xiě)。表1:標(biāo)準(zhǔn)氨基酸縮寫(xiě)
權(quán)利要求
1.一種聚核苷酸，其由編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的聚核苷酸，其中該核苷酸序列為SEQID NO :2。
3.—種重組核酸，其包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組核酸，其中該核苷酸序列為SEQID NO :2。
5.如權(quán)利要求3所述的重組核酸，其為載體。
6.如權(quán)利要求5所述的重組核酸，其為表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求4所述的重組核酸，其為載體。
8.如權(quán)利要求7所述的重組核酸，其為表達(dá)載體。
9.一種轉(zhuǎn)基因生物，其包含如權(quán)利要求1或2所述的聚核苷酸，或是如權(quán)利要求3至8 中任一項(xiàng)所述的重組核酸。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌、哺乳動(dòng)物、或植物細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸桿菌 (Iactobacilli)、或雙歧桿菌(bifidobacteria)。
12.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為酵母菌細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為畢氏酵母(Pichiapastoris)。
14.如權(quán)利要求9所述轉(zhuǎn)基因生物，其為多細(xì)胞真菌。
15.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為蘑菇。
16.如權(quán)利要求15所述轉(zhuǎn)基因生物，其為金針菇。
17.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因生物，其為植物。
18.如權(quán)利要求17所述轉(zhuǎn)基因生物，其為稻米、西紅柿、或香蕉。
19.一種多肽，其包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
20.一種診斷個(gè)體對(duì)家塵螨的過(guò)敏的方法，其包含檢測(cè)該個(gè)體是否會(huì)與如權(quán)利要求19 所述的多肽產(chǎn)生反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該個(gè)體罹患?xì)獯⒈茄住⒈歉]炎、濕疹、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏、結(jié)膜炎、及/或血管性水腫。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該檢測(cè)使用活體外之免疫分析進(jìn)行。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該免疫分析在取自該個(gè)體之樣本上進(jìn)行，并用以測(cè)定該樣本是否帶有對(duì)該多肽具有反應(yīng)性之抗體。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該樣本取自該個(gè)體之血清。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該抗體是IgE。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該檢測(cè)使用皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)進(jìn)行。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中該皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)包含將該多肽施用于該個(gè)體之皮膚上，點(diǎn)刺該個(gè)體之皮膚，并觀察該皮膚上是否產(chǎn)生發(fā)炎反應(yīng)。
28.—種診斷個(gè)體對(duì)家塵螨的過(guò)敏的組合物，其包含如權(quán)利要求19所述的多肽以及稀釋劑。
29.一種治療或預(yù)防個(gè)體的過(guò)敏性疾病的方法，其包含對(duì)該個(gè)體投與SEQ ID N0:1之多肽。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中該過(guò)敏性疾病與家塵螨有關(guān)。
31.如權(quán)利要求四所述的方法，其中該過(guò)敏性疾病是氣喘、鼻炎、鼻竇炎、濕疹、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏、結(jié)膜炎、或血管性水腫。
32.—種醫(yī)藥組合物，其包含如權(quán)利要求1所述之多肽，以及醫(yī)藥可接受之賦形劑或載體。
33.如權(quán)利要求32所述的醫(yī)藥組合物，其用于如權(quán)利要求四、30、或31所述的方法。
34.如權(quán)利要求32所述的醫(yī)藥組合物，其為疫苗的形式。
35.一種DNA疫苗，其包含如權(quán)利要求1或2的聚核苷酸，或是如權(quán)利要求3至8中任一項(xiàng)所述的重組核酸。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于一種名為歐洲塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)之家塵螨的第二群過(guò)敏原之新穎變體(稱為Der p 2變體)，及其用途。該新穎變體具有不同于其他已知Der p 2變體之cDNA及蛋白序列變異。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102307894SQ200880132578
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者林克亮, 蔡考圓, 郭奕君, 黃瓊慧 申請(qǐng)人:蔡考圓