專利名稱：珍珠貝外套膜組織的離體培養方法及培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種水生無脊椎動物的組織培養技術及應用領域，特別是珍珠貝外套膜組織 的離體培養方法及培養基。
背景技術：
珍珠是由珍珠貝體內的珍珠囊分泌珍珠質而形成的，珍珠囊是珍珠貝外套膜的上皮細胞 受到刺激后增殖形成的，因此珍珠貝的外套膜在珍珠形成中起著重要的作用。現代人工珍珠 培養方法是將供體珍珠貝外套膜組織塊單獨或與珠核一道植入受體珍珠貝體內形成無核珍珠 或有核珍珠。在插植手術過程中，上皮細胞貼附于珠核的位置、緊密程度、組織塊的面積、 形狀及取材的位置、植核位置、植核手術時對育珠貝的機械損傷程度都直接關系到珍珠囊的 形成和上皮細胞的分泌狀態，常引起各種疵珠的產生，如污珠、尾巴珠、素珠等。此外，外 套膜植片法還會使育珠貝損傷嚴重，增加植核后育珠貝的死亡率和吐核率，從而嚴重地影響 珍珠的質量和產量。由于外套膜植片法固有的缺陷，學者們根據珍珠形成的原理，利用組織 培養技術及細胞培養技術、體外培育有核珍珠囊，再進行插囊育珠，試圖建立一種新的珍珠 培育方法。
對于珍珠貝外套膜的組織培養國內外已開展了不少工作，日本學者町井昭(Machii)從 20世紀60年代末期就對日本產的馬氏珠母貝外套膜組織培養進行了系統的研究，使培養的 外套膜組織在體外存活30d左右并能分泌微型顆粒的珍珠質，我國四川大學的石安靜等從80 年代初期對我國的淡水珍珠蚌、三角帆蚌、褶紋冠蚌和背角無齒蚌的外套膜組織培養進行深 入的研究，不但成功地建立組織培養技術和方法，而且對外套膜組織在體外培養中產生的分 泌物(珍珠質)的性質進行了分析。學者們既往遇到的一個共同難題是，外套膜細胞培養難 以形成細胞系，后續工作無法開展[喻達輝，蘇天鳳.生物技術在珍珠養殖業中的應用.水產科 技，2000， (1) : 13]。
本發明人認為，目前對珍珠貝類的生理、生化研究薄弱，尤其是對珍珠貝類的免疫機制 尚不清楚，在實驗室中直接培養出真正意義的珍珠是困難的，但采取組織培養或細胞培養的 方法，幫助外套膜上皮細胞盡快與珠母貝建立血液循環關系，加速珍珠囊的形成；減少細胞、
4組織塊及珠核植入過程對珠母貝造成的傷害，不但對提高海水有核珍珠的成珠率是有幫助的， 而且，在海水無核珍珠(主要為藥用)的生產中有特別重要的意義，也較容易在生產中得到 推廣。
廣西海洋研究所王愛民等同志從20世紀90年代初對體外培養有核珍珠囊進行研究，研 究得出一個共同的結果是用外套膜細胞培養形成的體外珍珠囊用于插囊育珠無法得到珍珠， 而將外套膜組織塊培養形成的體外珍珠囊用于插囊育珠能夠得到珍珠。說明，細胞培養懸液 所形成的珍珠囊還不是完善的珍珠囊，而由外套膜組織培養形成的珍珠囊才具有完整的結構 和功能。在體外培養珍珠囊最重要的是建立完整的珍珠囊結構。由于目前尚無法精確地分離 外套膜組織中的各類細胞，特別是外上皮細胞、內上皮細胞和結締組織細胞三類細胞，因此 無法按比例在體外建立珍珠囊。其結果是雖然有不少細胞粘附在珠核上，但細胞之間無法建 立應有的連接，故單純的細胞培養法不能形成結構完整的體外珍珠囊。相反，用外套膜組織 塊貼附在珠核上進行培養，外套膜組織建立體外珍珠囊的過程同體內建立珍珠囊的過程基本 上是一致的，外上皮細胞從外套膜組織塊中遷出，沿著珠核的表面移動，逐漸包裹珠核表面， 同時外套膜組織中的結締組織細胞再包裹在外上皮細胞表面，最終形成結構較完整的珍珠囊，
這種珍珠囊是真正意義上的珍珠囊。
但是用外套膜組織塊形成的體外珍珠囊用于插囊育珠實驗出現成珠率低、素珠多和育珠 貝死亡率高的情況，這同插核技術無不相關，這是因為切口的大小及珠核通過切口運至預定 核位的方式直接影響到體外珍珠囊的結構變化。若體外珍珠囊在珠核上貼附不牢固、切口過 小，就會造成體外珍珠囊受到破壞，使它們在到達預定核位之前完全脫落，無法產生珍珠， 只能是素珠，而保持完整結構珍珠囊的珠核最終產生珍珠。王愛民等雖然對插入工藝進行了 改進，但插囊育珠技術應用于海水養殖，只是取得4.05%的成功率，要應用于生產，還有很多 基礎工作要做(王愛民，閻冰,蘇瓊，等.馬氏珠母貝珍珠囊體外培養及插囊育珠.廣西科學， 2000， 7(1): 70)。

發明內容
本發明的目的主要是針對以上技術的不足以及既往實驗中反映出的問題，提供一種珍珠 貝外套膜組織的離體培養方法及培養基。
本發明人本著與珠母貝生態接近的思路，緊緊抓住降低成本，易于操作，便于推廣，提 高產量及質量的生產技術環節，本發明人開展了一系列有益的工作。
從上述背景技術得知，由于珍珠的形成是通過珍珠囊來實現的，因此，國內外學者都比 較關注珍珠囊的形成和珍珠囊的結構。在珍珠囊形成和結構的細節上，不同學者研究的結果 雖然有差異，但他們普遍認為外套膜植片(組織)外上皮細胞經遷移和增殖能形成珍珠囊的上皮細胞，其結締組織細胞和受體貝的結締組織細胞共同圍繞珍珠囊上皮細胞組成完整的珍 珠囊，而外套膜植片的內上皮細胞則退化，不參加珍珠囊的形成。在體外培養珍珠囊時既要 解決體外珍珠囊的細胞組成問題，又要解決細胞在珠核表面的粘附問題。為快速獲得結構完 整的體外珍珠囊，本發明技術選擇了經短時間消化后的外套膜上皮組織培養；為了更好地解 決細胞在珠核表面的粘附問題并且降低生產成本，本發明技術從植珠過程的棄料閉殼肌等軟 組織中提取高分子的貼壁物質，工藝簡單價格低廉，成功解決了細胞的粘附問題。
本發明的方法主要包括貝外套膜組織的離體培養基(培養液)以及貝外套膜離體培養方法。
珠母貝類為低等無脊椎動物，市售的培養基是針對脊椎動物及昆蟲細胞培養研發的，照 搬通用的細胞培養方案運用于貝類外套膜上皮細胞培養，并不能獲得理想的效果，且試劑價 格昂貴，配劑繁雜，為此，我們對培養基進行了改進。
本發明的珍珠貝外套膜組織的離體培養基(培養液)包括天然海水、水解珍珠液、貝液 和抗生素，其主要原料和質量份數如下
水解珍珠液 0. 1-0.5份；
貝液 2-10份；
抗生素 0. 01-0. 03份；
海水 90-100份。
以上所述的水解珍珠液是將洗凈的珍珠母貝用醋酸浸泡，軟化，經機械打磨，得到純凈 的珍珠層片，經烘干、粉碎、磨細，用硫酸加熱水解，碳酸鈣或石灰乳中和，真空濃縮，活 性炭脫色除雜，得到珍珠原液。
或者是將珍珠質粉和pH2. 5 6的蜂蜜按0. 1 5 : 100混合后在5°C以上室溫攪拌，或室 溫攪拌后再隔水逐段加溫攪拌2 3小時，得到。
以上所述的抗生素是含青霉素類、鏈霉素類抗生素，可以是青霉素-鏈霉素雙抗溶液，或 者是單一的青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素或硫酸鏈霉素。青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃 度為0. lg/L。
以上所述的貝液是貝組織液或貝血清，貝組織液是取珠貝體內的液體經過濾除菌得到， 貝血清是從珍珠貝心臟或大血管中取血，經離心，取上清液即為珍珠貝血清。其中的過濾除 菌可以采用板框過濾器、微孔濾膜密閉過濾等形式。
以上所述的貝外套膜組織的離體培養基的pH值為6.8 7.2，如果偏離，可以用鹽酸或
氫氧化鈉調整酸堿度。
本發明的珍珠貝外套膜組織的離體培養方法如下
61、 準備培養皿
本發明的培養皿可以使用陶瓷或玻璃容器，但是培養皿的底面用自制的從貝閉殼肌或外 套膜組織提取的貼壁物質預先處理，該貼壁物質從貝閉殼肌或外套膜提取后干燥消毒，待用。
2、 體外珍珠囊的培養
常規取材獲得珍珠貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成約1鵬3 2咖3大 小的組織塊，置0. 1-0.8%的蛋白酶溶液(過濾除菌，4。C儲存備用)中，在攝氏20。C-25°C 的溫度下消化5 10min后加入自制的培養液中止消化。將經初步消化的組織塊分別置于35腿 X10 mm培養皿中(或貼附于已涂抹貼壁物質的珠核上)，每個培養皿底部貼15—25塊組織 塊(如采用不同大小規格的培養皿，貼附的組織塊數目應參照此密度作調整)，擺放組織塊后， 向培養皿內加入少量的培養液，以能保持組織塊濕潤即可。蓋好瓶蓋，置于2(TC培養箱中或 攝氏2(TC-28'C的無菌環境中進行培養。24h后補加一次培養基。隔天或視細胞生長狀況換液。 通過該方法培養的珍珠貝外套膜組織4h后上皮細胞從組織中遷出并迅速增多，生長狀況良 好，2天后有效地形成體外珍珠囊。
所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶等商品酶。 所述的蛋白酶溶液的制備是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸餾水中配制成0. 1-0. 8%的蛋 白酶溶液，混勻，過濾除菌，4"C備用，其中的過濾除菌可以采用板框過濾器、微孔濾膜密閉 過濾等形式。
3、 珍珠囊移植與珍珠的養殖
以彎頭吸管將珍珠囊移植于育珠貝體內，或與珠核一同移植育珠貝體內，休養期過后將 手術貝放置于溫度范圍為15-30'C海水中吊養9-12個月，能取得較高的成活率及成珠率，獲 得高質量的無核珍珠或有核珍珠。
以上所述的采用的健康珠母貝是指珍珠養殖生產中主要的海產貝種，包括馬氏珠母貝、 解氏珠母貝、白蝶珠母貝、黑氏珠母貝、企鵝珍珠貝。
以上所述的提供外套膜上皮組織以及貝血清的珠母貝是同一種屬的海產貝，或者是不同 種屬的，只要是貝類血清就可以了。如果以上述取外套膜上皮組織的珍珠貝取貝血清，可以 大大降低成本。
以上所述的注入育珠貝體內的體外珍珠囊可以注射到不同品種的珠母貝。 本發明的有益效果在于
1、被移植到育珠貝體內的是在體外培育形成的珍珠囊，而不是珠母貝外套膜組織塊，更 區別于傳統的用器械直接挾持珠核插入的方法，植入的珍珠囊比組織塊更宜于在珠母貝體內 生長。2、 成活率及成珠率高組織塊經過初步消化，遷出迅速，移植到育珠貝體內的是細胞結 構完整的珍珠囊，易于與育珠貝建立血液循環關系，且采用彎頭吸管注入的方法，對育珠貝 基本沒有造成損傷，也沒有對珍珠囊的損傷，故應用本發明的技術珠貝成活率及成珠率高。 既往報道用外套膜上皮組織培養的珍珠囊插囊育珠成珠率只是4. 05%，據我們觀察海水插片 育無核珠的成珠率只有25%左右，有核海水珍珠優質珠在30%左右，而用本發明技術成珠率及 優質珠在50%以上，休養期及育珠期珠貝成活率提高10%以上。
3、 成本低供給外套膜上皮、貝組織液、貝血清及貝閉殼肌的可以使用同一貝體，節約 了貝資源；另外，由于對珠母貝損傷少，可以在插入有核珍珠囊的珠貝中選取不同位置注入 無核珍珠囊培養無核珍珠，既可以收獲觀賞珠又可以收獲藥用珠，增加珠農的收入。
4、 操作簡單，減少污染機會，降低污珠率國內養殖場普遍條件較差，手術過程很難做 到無菌操作，彎頭吸管注入法比插入法操作方便，珍珠囊粘附好，操作人員易掌握，對珠貝 損傷少，減少了感染機會，降低了污珠率。
5、 社會效益及經濟效益顯著天然珍珠及優質珍珠的價格歷來比黃金貴，本發明為提高 珍珠的產量及質量提供了技術支撐，對于弘揚南珠文化，提高中國南珠的國際地位，增加珠 農收入，帶動和支持地方經濟建設具有重要的意義。
具體實施例方式
下面結合實例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍并不限于此。 一、專用培養基的配制 實施例1
取100ml煮沸的天然海水，加入貝組織液或貝血清2-10ml，(貝組織液是用馬氏珠母貝 體內的液體經過濾除菌得到，貝血清是從珍珠貝心臟或大血管中取血，經離心，取上清液得 到珍珠貝血清)，加入0. 1-5%水解珍珠液10ml，并加入100IU/ml青霉素lml, 0. lg/L鏈霉素 lml，調pH值至6.8-7.2。水解珍珠液的配制是將珍珠質粉和pH2. 5 6的蜂蜜按0. 1 5 : 100混合后在5'C以上室溫攪拌，或室溫攪拌后再隔水逐段加溫攪拌2 3小時，得到。
實施例2
取100ml煮沸的天然海水，加入貝組織液或貝血清2-10ml，(貝組織液是用馬氏珠母貝 體內的液體經過濾除菌得到，貝血清是從珍珠貝心臟或大血管中取血，經離心，取上清液得 到珍珠貝血清)，加入0. 1_5%水解珍珠液10ml，并加入100IU/ml氨芐青霉素2ml，或0. lg/L 硫酸鏈霉素2ml，調pH值至6.8-7.2。水解珍珠液的配制是將洗凈的珍珠母貝用醋酸浸泡， 軟化，經機械打磨，得到純凈的珍珠層片，經烘干、粉碎、磨細，用硫酸加熱水解，碳酸鈣 或石灰乳中和，真空濃縮，活性炭脫色除雜，得到珍珠原液。二、珍珠貝外套膜組織的離體培養方法 實施例1
(1) 按比例秤取胰蛋白酶，溶解于三蒸水中配制成O. 1-0.5%的胰蛋白酶溶液，混勻， 過濾除菌，fC備用；按常規方法取出l-2齡的健康馬氏珠母貝外套膜上皮組織，除去裙帶部 分，凈化處理后切成約1鵬3 2腦3大小的組織塊，置胰蛋白酶溶液中作初步消化，溫度為攝 氏20。C-25°C，時間是5 10min。加入下述培養液中止消化。
(2) 專用培養基配制可快速從從上述提供外套膜上皮組織的馬氏珠母貝體中提取貝組 織液，貝血清(從珍珠貝心臟或大血管中取血，離心取上清液即為珍珠貝血清)；微孔濾膜密 閉過濾，也可以事先從同種馬氏珠母貝制備貝血清于-20'C保存(也可以用不同種的貝血 清)。使用前置入4'C融化，盡快使用，使用之前無需水浴滅活處理；配制珍珠水解液，過 濾滅菌后使用。
(3) 將經初步消化的組織塊分別置于35腿XIO隱培養皿中(或貼附于已涂抹貼壁物 質的珠核上)，培養瓶的底面(或珠核)用自制的從貝閉殼肌等軟組織提取的貼壁物質預先處 理。每個培養皿底部貼15 — 25塊組織塊(如采用不同大小規格的培養皿，貼附的組織塊數目 應參照此密度作調整)，擺放組織塊后，向培養皿內加入少量的培養液，以能保持組織塊濕潤 即可。蓋好瓶蓋，置于攝氏20'C無菌培養箱中(或攝氏2(TC-25'C的無菌環境中)進行培養。 24h后補加一次培養基。隔天或視細胞生長狀況換液。通過該方法培養的珍珠貝外套膜組織 4h后上皮細胞從組織中遷出并迅速增多，生長狀況良好，2天后有效地形成體外珍珠囊。
(4)以玻璃彎頭吸管將珍珠囊移植于育珠貝體內，或與珠核一同移植育珠貝體內，休養期 過后將手術貝放置于溫度范圍為15-3(TC海水中吊養9-12個月，能取得較高的成活率及成珠 率，獲得高質量的無核珍珠或有核珍珠。 實施例2
(1) 秤取0. 15g的菠蘿蛋白酶溶解于50ml的三蒸水中配制成0. 3%的菠蘿蛋白酶溶液， 混勻，過濾除菌，4。C備用；按常規方法取出l-2齡的健康白蝶珠母貝外套膜上皮組織，除去 裙帶部分，凈化處理后切成約lmm3 2ram3大小的組織塊，置菠蘿蛋白酶溶液中作初步消化， 溫度為攝氏20。C-25°C，時間是5 10min。加入下述培養液中止消化。
(2) 專用培養基配制可快速從上述提供外套膜上皮組織的白蝶珠母貝體中提取貝組織 液(濾過除菌)及貝血清(從珍珠貝心臟或大血管中取血，離心取上清液即為珍珠貝血清)； 也可以事先從同種白蝶珠母貝制備貝血清于-20保存，或者不同種的貝血清。使用前置入4 。C融化，盡快使用，使用之前無需水浴滅活處理；配制珍珠水解液，過濾滅菌后使用。
(3) 將經初步消化的組織塊分別置于35誦XIO mm培養皿中(或貼附于已涂抹貼壁物
9質的珠核上)，培養瓶的底面(或珠核)用自制的從貝閉殼肌等軟組織提取的貼壁物質預先處 理。每個培養皿底部貼15 — 25塊組織塊(如采用不同大小規格的培養皿，貼附的組織塊數目 應參照此密度作調整)，擺放組織塊后，向培養皿內加入少量的培養液，以能保持組織塊濕潤 即可。蓋好瓶蓋，置于攝氏2(TC無菌培養箱中(或攝氏2(TC-25'C的無菌環境中)進行培養。 24h后補加一次培養基。隔天或視細胞生長狀況換液。通過該方法培養的珍珠貝外套膜組織 4h后上皮細胞從組織中遷出并迅速增多，生長狀況良好，2天后有效地形成體外珍珠囊。
(4)以玻璃彎頭吸管將珍珠囊移植于育珠貝體內，或與珠核一同移植育珠貝體內，休養期 過后將手術貝放置于溫度范圍為15-3(TC海水中吊養9-12個月，能取得較高的成活率及成珠 率，獲得高質量的無核珍珠或有核珍珠
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權利要求
1、一種珍珠貝外套膜組織的離體培養方法，其特征在于(1)準備培養皿，采用陶瓷或玻璃容器作為培養皿，培養皿的底面用自制的從貝閉殼肌或外套膜組織提取的貼壁物質預先處理，該貼壁物質從貝閉殼肌或外套膜提取后干燥消毒，待用；(2)體外珍珠囊的培養，常規取材獲得珍珠貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成約1mm3～2mm3大小的組織塊，置0.1-0.8％的蛋白酶溶液，過濾除菌，4℃儲存備用，在攝氏20℃-25℃的溫度下消化5～10min后加入培養液中止消化，將經初步消化的組織塊分別置于35mm×10mm培養皿中，或貼附于已涂抹貼壁物質的珠核上，每個培養皿底部貼若干塊組織塊，擺放組織塊后，向培養皿內加入少量的培養液，蓋好瓶蓋，置于20℃培養箱中進行培養，24h后補加一次培養基，隔天或視細胞生長狀況換液；(3)珍珠囊移植與珍珠的養殖，以彎頭吸管將珍珠囊移植于育珠貝體內，或與珠核一同移植育珠貝體內，休養期過后將手術貝放置于溫度范圍為15-30℃海水中吊養9-12個月，能取得較高的成活率及成珠率，獲得高質量的無核珍珠或有核珍珠。
2、 根據權利要求1所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養方法，其特征在于所述的采用 的健康珠母貝是指珍珠養殖生產中主要的海產貝種。
3、 根據權利要求1所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養方法，其特征在于所述的提供 外套膜上皮組織以及貝血清的珠母貝是同一種屬的海產貝或者是不同種屬的海產貝種。
4、 根據權利要求1所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養方法，其特征在于所述的注入育珠貝體內的體外珍珠囊注射到相同或不同品種的珠母貝。
5、 根據權利要求1所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養方法，其特征在于所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠蘿蛋白酶的商品酶，蛋白酶溶液的制備是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸餾水中配制成O. 1-0.8%的蛋白酶溶液，混勻，過濾除菌，4r備用。
6、 一種如權利要求1所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養液，其特征在于它包括天然 海水、水解珍珠液、貝液和抗生素，其主要原料和質量份數如下水解珍珠液 0.1-0. 5份；貝液 2-10份；抗生素 0.01-0.03份；海水 90-100份。
7、 根據權利要求6所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養液，其特征在于水解珍珠液是將洗凈的珍珠母貝殼用醋酸浸泡，軟化，經機械打磨，得到純凈的珍珠層片，經烘干、粉碎、 磨細，用硫酸加熱水解，碳酸鈣或石灰乳中和，真空濃縮，活性炭脫色除雜，得到珍珠原液； 或者是將珍珠質粉和pH2. 5 6的蜂蜜按0. 1 5 : 100混合后在5'C以上室溫攪拌，或室溫 攪拌后再隔水逐段加溫攪拌2 3小時，得到。
8、 根據權利要求6所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養液，其特征在于所述的抗生素是含青霉素類、鏈霉素類抗生素，選擇青霉素-鏈霉素雙抗溶液，或者是單一的青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素或硫酸鏈霉素，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為0. lg/L。
9、 根據權利要求6所述的珍珠貝外套膜組織的離體培養液，其特征在于所述的貝液是 貝組織液或貝血清，貝組織液是取珠貝體內的液體經過濾除菌得到，貝血清是從珍珠貝心臟 或大血管中取血，經離心，取上清液即為珍珠貝血清。
全文摘要
本發明公開了一種珍珠貝外套膜組織的離體培養方法及其專用培養液，該培養基包括水解珍珠液、貝液、抗生素和海水，常規從珠母貝取材獲得外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成約1mm³～2mm³大小的組織塊，置于蛋白酶溶液中，消化后加入上述培養液中止消化。將經初步消化的組織塊分別置于培養皿中或貼附于已涂抹貼壁物質的珠核上，通過該方法培養的珍珠貝外套膜組織生長狀況良好，4h細胞從組織塊中遷出，2d后有效地形成體外珍珠囊。該方法可以在插入珍珠核的珠貝中選取不同位置注入無核珍珠囊培養無核珍珠，成本低，成活率及成珠率高，對珠母貝損傷少。
文檔編號A01K61/00GK101491229SQ20091011389
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月2日 優先權日2009年3月2日
發明者強 劉, 華 單, 銘 戴, 李中華, 輝 楊, 楊繼峰, 江 林, 海 林, 湧 林, 林其溪, 勤 王, 王乃平, 霖 甘, 鄧家剛, 陳明偉 申請人:廣西中醫學院;林 湧