專利名稱：亨利兜蘭種子試管苗的培育方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培育技術領域，特別是涉及亨利兜蘭種子試管苗的一種無菌培育方法。
背景技術：
亨利兜蘭(Paphiopedilum henryanum Braem)是蘭禾斗(Orchidaceae)兜蘭屬(P即hiopedium)植物，是國家一級重點保護瀕危物種。《華盛頓公約》(即《瀕危野生動植物禾中國際貿易公約》，Convention on Interiiatioiial Trade in Endangered Species ofWild Fauna and Flora, CITES)把所有兜蘭屬植物列入其附錄一名錄，受到國際社會的嚴格保護。兜蘭是蘭科植物中最具特色的一個類群，也是最奇特的觀賞蘭花。花形奇特，唇瓣呈兜狀，酷似舊時歐洲淑女的拖鞋，故又稱拖鞋蘭。背萼特別發達，具有艷麗的花紋。兜蘭與其他蘭花明顯不同的地方是2枚能育雄蕊著生在蕊柱的兩側；發達的背萼呈扁圓形或倒心形，在各瓣中最顯著。因此，兜蘭以其獨特魅力和許多優異特性而備受世界花卉愛好者的鐘愛。
亨利兜蘭分布于中國云南、廣西、貴州，越南、緬甸也有分布。花色粉紅，上萼片具斑點。花期為夏秋季。亨利兜蘭同大多數蘭花一樣，種子沒有胚乳，在自然環境中需與真菌共生才能萌發，且萌發率極低。蘭花的傳統繁殖方式為分株繁殖，繁殖系數低、速度慢，難以滿足保護和開發的要求。蘭花的組織培養始于20世紀60年代，之后組培在其它許多蘭花上獲得了成功。但兜蘭人工授粉結實率低，其無菌播種和組織培養難度大，是蘭科植物中種子試管培養最困難的屬之一。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供亨利兜蘭種子試管苗的一種無菌培育方法，該方法經過對培養基的篩選，優選出適合亨利兜蘭種子試管苗培育的培養基，種子萌發率能達到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上。
為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案本發明亨利兜蘭種子試管苗的培育方法(1) 種子萌發將亨利兜蘭果實滅菌后取出種子，接種于種子萌發培養基上，暗培養3周后轉入弱光培養，至種子發育成原球莖，種子萌發培養基為1/4MS + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 增殖分化將原球莖轉接到增殖分化培養基上，弱光培養至原球莖分化出芽，增殖分化培養基為1/2MS + 0.5 2.0mg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 壯苗生根然后將芽轉接到壯苗生根培養基上進行生根培養后即可煉苗移栽，壯苗生根培養基為1/2MS + l.Omg/L NAA + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
上述增殖分化培養基為1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4
前述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法中，所述弱光培養的光照強度為500 1000Lx，培養溫度為23 27。C。
進一步的，前述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法
(1) 種子萌發首先將授粉150天的亨利兜蘭果實經表面消毒處理后，在超凈工作臺上剖開果實，取出種子后接種于種子萌發培養基上，暗培養3周后轉入弱光培養，至種子發育成原球莖；
(2) 增殖分化將原球莖轉接到增殖分化培養基上，弱光培養至原球莖分化出芽，出芽后10周再繼代增殖培養一次；
(3) 壯苗生根然后將芽轉接到壯苗生根培養基上進行生根培養，光照強度增加至2000 3000Lx，當苗長至4 5厘米高、根長l. 5 2厘米時即可煉苗移栽。
上述技術方案是通過實驗篩選出來的，具體如下
1、實驗培養基
種子萌發培養基
(1) MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 1/2MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 1/4 MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;原球莖增殖及分化培養基
(4) 1/2MS+2. Omg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;(5) 1/2MS+1. 0mg/L 6-BA+0. 5 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
(6) 1/2MS+0. 5mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4;
生根壯苗培養基
(7) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH5. 2 5. 4
(8) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +6-BAO. 5mg/L +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
2、實驗方法
2. l人工授粉溫室大棚里人工馴化栽培的亨利兜蘭自然結實率低，需經人工進行自花或異花授粉，這也是選育新品種的主要手段。
2.2種子滅菌取授粉150d的果實用自來水凈后，用75%的酒精表面消毒303，再用O. 1%升汞液消毒15min，無菌水沖洗5次，再浸入95。/。的酒精ls，取出后于酒精燈上點燃，燒盡表面酒精后，在超凈工作臺上剖開果實，取出種子接種于種子萌發培養基(1) 、 (2) 、 (3)上。進行暗培養3周，轉入弱光培養(500 1000Lx)，培養溫度(25±2) °C ， 7周左右發育成原球莖。培養基(1)的種子幾乎沒有萌發；培養基(2)上種子萌發率10%;培養基(3)種子萌發率達45%。可見低鹽濃度有利于種子萌發。
2.3原球莖增殖與分化將原球莖轉接到原球莖繼代增殖分化培養基(4) 、 (5) 、 (6)上，弱光培養(500 1000Lx)，培養溫度(25±2) °C 。原球莖均能迅速分化出芽，其中培養基(4)上效果最好，10周左右可繼代增殖1次。結果表明細胞分裂素與生長素的比例以10: l效果最佳。
2.4壯苗生根培養將小苗分成單株后轉接到壯苗生根培養基(7) 、 (8)上，進行生根培養，光照增加至2000 3000Lx，其中培養基(7)上根系生長較好。當苗長至4 5cm高，根長1.5 2.0cm，可進行煉苗移栽。
2.5煉苗移栽將培養瓶置于大棚中煉苗l周后，取出小苗，洗凈培養基，先種植于苔蘚中(苔蘚用1000倍多菌靈消素)，2個月后轉于樹皮基質中(用1000倍多菌靈消素)，成活率90%以上。
與現有技術相比，本發明通過對培養基的篩選，優選出了適合亨利兜蘭種子萌發、增殖分化和壯苗生根的培養基，種子萌發率可達到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上
6，為亨利兜蘭的快速繁殖、雜交選育、保護和開發應用提供了一種有效的培育方法。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
詳細說明本發明。
(1) 種子萌發首先將亨利兜蘭果實滅菌，取授粉150天的亨利兜蘭果實用自來水洗凈 ，用75%酒精表面消毒30秒，再用O. 1%升汞液消毒15分鐘，無菌水沖洗5次，再浸入95%酒 精1秒，取出后于酒精燈上燒盡果實表面的酒精，在超凈工作臺上剖開果實，取出種子后接 種于種子萌發培養基上，暗培養3周后轉入弱光培養，至種子發育成原球莖，種子萌發培養 基的組成為1/4MS + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5.2 5.4;這里選擇低鹽濃度的培養基，有利于種子的萌發，萌發率在45%以上。
(2) 增殖分化將原球莖轉接到增殖分化培養基上，弱光培養至原球莖分化出芽，出 芽后10周再繼代增殖培養一次；優選增殖分化培養基組分為1/2MS + 2.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂 ,PH 5.2 5.4。
(3) 壯苗生根然后將芽轉接到壯苗生根培養基上進行生根培養，光照強度增加至 2000 3000Lx，當苗長至4 5厘米高、根長l. 5 2厘米時即可煉苗移栽，壯苗生根培養基為 :1/2MS + 1.0mg/L NAA + 15% (體積)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
(4) 煉苗移栽將培養瓶置于大棚中煉苗l周后，取出小苗，洗凈培養基，先種植于苔 蘚中(苔蘚用1000倍多菌靈消素)，2個月后轉于樹皮基質中(用1000倍多菌靈消素)，成 活率90%以上。
上述具體實施方式
中的弱光培養的光照強度為500 1000Lx，培養溫度為23 27。C。
權利要求
1.亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于(1)種子萌發將亨利兜蘭果實滅菌后取出種子，接種于種子萌發培養基上，暗培養3周后轉入弱光培養，至種子發育成原球莖，種子萌發培養基為1/4MS+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4；(2)增殖分化將原球莖轉接到增殖分化培養基上，弱光培養至原球莖分化出芽，增殖分化培養基為1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4；(3)壯苗生根然后將芽轉接到壯苗生根培養基上進行生根培養后即可煉苗移栽，壯苗生根培養基為1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，PH 5.2～5.4。
2.按照權利要求l所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于:步驟(2)中所述的增殖分化培養基為1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%瓊脂，PH 5. 2 5. 4。
3.按照權利要求l所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于:所述弱光培養的光照強度為500 1000Lx，培養溫度為23 27。C。
4.按照權利要求1至3任一項所述亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，其特征在于(1) 種子萌發首先將授粉150天的亨利兜蘭果實經表面消毒處理后，在超凈工作臺上剖開果實，取出種子后接種于種子萌發培養基上，暗培養3周后轉入弱光培養，至種子發育成原球莖；(2) 增殖分化將原球莖轉接到增殖分化培養基上，弱光培養至原球莖分化出芽，出芽后10周再繼代增殖培養一次；(3)壯苗生根然后將芽轉接到壯苗生根培養基上進行生根培養，光照強度增加至2000 3000Lx，當苗長至4 5厘米高、根長l. 5 2厘米時即可煉苗移栽。
全文摘要
本發明公開了一種亨利兜蘭種子試管苗的培育方法，包括種子萌發、增殖分化和壯苗生根，種子萌發培養基為1/4MS+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4；增殖分化培養基為1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4；壯苗生根培養基為1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(體積)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％瓊脂，pH 5.2～5.4。本發明方法的種子萌發率可達到45％以上，成苗率、移栽成活率均在90％以上。
文檔編號A01H4/00GK101558744SQ20091030291
公開日2009年10月21日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者羅曉青 申請人:貴州省亞熱帶作物研究所