專利名稱：一種氣虛發熱動物模型及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中醫疾病研究的模型領域，具體涉及一種用于氣虛發熱病癥研究的氣 虛發熱動物模型及其制備方法。
背景技術：
近幾年來有關各種氣虛證的造模方法形式多樣，有疲勞加飲食失節或瀉下去，偏 食苦味或酸味，耗氣破氣或苦寒瀉下加耗氣破氣等(李軍蘭，方肇勤.氣虛證動物模型造模 方法[J].上海中醫藥大學學報，2004，18(3) :56-60.)。目前比較公認的氣虛造模方法主 要有單純疲勞法、疲勞加飲食失節法、疲勞加瀉下法、煙熏法及手術(吳捷，劉勤社，高潔， 等.養血婦康顆粒劑對實驗性氣血虛證動物的影響[J].陜西中醫，2002，23 (5) =467-469.； 陳家旭，陳易新，季紹良，等.瀉下、勞倦因素致脾氣虛下鼠下丘腦、血漿NPY含量的變化 [J].北京中醫藥大學學報，2002，25(6) =22-24.；田道法，唐發清，周小軍，等.氣虛證模型 大鼠反義DNA陣列A區基因表達譜特征的初步研究[J].湖南中醫學院學報，2001，21(2) 1-3.；高雪，李浩，曲敬來，等.補肺湯對肺氣虛證大鼠下呼吸道病理變化的影響[J].中 醫藥信息，2000，17 (5) :55-56.)，但總體上以采用疲勞的方法為主，在疲勞的基礎上加用限 食、瀉下等方法。有研究表明，應用疲勞加限食法制作的動物氣虛模型更符合中醫理論，可 使氣更不足，氣虛癥候更明顯。氣虛多由先天稟賦不足，或后天失養，或勞傷過度而耗損(勞則氣耗)，或久病 不復，氣的生化不足等所致(張珍玉.對中醫學氣的認識[J].浙江中醫學院學報，2000， 24(1) :32-32.)，臨床上可導致多種病證的發生，發熱是其中之一，熱勢或高或低，但因氣虛 所致，故發熱多在勞累后發作或加劇。目前實驗大鼠發熱模型主要以酵母、內毒素(LPS)和 2，4_ 二硝基酚最為常見，其共同的特點是造模方便，成功率高，對實驗條件要求也比較低。 其中LPS誘導的發熱與傳統的中醫學癥候所致發熱相似，是較經典的發熱模型，因此常用 于篩選中藥解熱藥物并探討發熱機制(唐曉峰，薛漫清，王暉.大鼠發熱模型及發熱機制的 研究進展[J].廣東藥學院學報，2009，25 (3) :327-331.)。PGE是公認的中樞發熱介質(金惠銘主編.病理生理學.北京.人民衛生出版社， 第五版，2001 :96.)。研究資料表明，致熱原引起發熱時，腦脊液及下丘腦中？6氏含量明顯 增加。動物側腦室注入微量的PGE2可誘導發熱反應，并且PGE2可直接刺激P0/AH區溫度敏 感神經元，改變其放電頻率，抑制PGE合成和釋放的物質能抑制發熱反應(趙紅艷，范書擇， 孫麗華等.黃芩甙對發熱大鼠下丘腦PGE2和cAMP含量的影響[J].中國應用生理學雜志， 2002,18(2) :139-141.)。根據以往的資料，國內多數學者主張cAMP也是發熱的中樞介質之 一。胡景新等靜脈注射ET或EP引起家兔雙相熱時，腦脊液和下丘腦中cAMP含量均明顯增 多，且與體溫上升呈顯著正相關(張量，佟雷，楊宇等.低溫時蛙皮素對IL-10致熱大鼠下 丘腦和血漿cAMP含量的影響[J],中國臨床藥理學與治療學，2005，10 (12) 1354-1357.)。中醫基礎理論認為(張惠敏，鄭守曾.氣虛體質的研究進展[J].北京中醫藥大學 學報，2004，27(1) :14-16.)，精、氣、血、津液是構成和維持人體生命活動的基本物質，氣虛
3則生血不足、氣虛則血行不暢、氣虛則津停，所以氣虛往往與血虛、血瘀、痰濕相互兼夾，形
成復雜的體質。明代的萬全言“......如受肺之氣為皮毛，肺氣不足，則皮脆薄怯寒，毛發
不生；受心之氣為血脈，心氣不足，則血不華色，面無光彩；受脾之氣為肉，脾氣補助，則肌 肉不生，手足如削；受肝之氣為筋，肝氣不足，則骨軟。”還有研究表明，制作病證結合動物模 型是研究氣虛發熱癥的重要途徑(羅堯岳.氣虛血瘀證動物模型的研究述評[J].湖南中 醫學院學報，2004，24 (5) =57-58.)

發明內容
本發明的目的在于根據現有的氣虛發熱動物模型的研究較少，而氣虛發熱病癥又 是臨床常見病癥之一，通過游泳勞損法加限食法，提供一種氣虛發熱動物模型。本發明另一目的在于提供上述氣虛發熱動物模型的制備方法。本發明還有一個目的在于提供上述氣虛發熱動物模型的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種氣虛發熱動物模型，該模型是采用游泳勞損法加限食法得到大鼠氣虛發熱模 型。本發明氣虛發熱動物模型的制備方法包括如下步驟將大鼠控制飲食并力竭游 泳，腹腔注射LPS。作為一種優選方案，上述制備方法中，所述控制飲食是將大鼠的喂食量降為常規 飲食量的1/2 1/3。作為一種優選方案，上述制備方法中，所述大鼠力竭游泳時，不能以尾撐在底部休 息，持續游泳到下沉，經10s后仍不能返回水面為止，每天游泳1 2次，持續3 4周。作為一種優選方案，上述制備方法中，所述大鼠力竭游泳時的水溫為18 25°C。作為一種優選方案，上述制備方法中，所述腹腔注射LPS的量為60 lOOy g/kg， 最優選為80iig/kg。通過本發明的實驗發現，氣虛癥的大鼠被毛稀疏易脫落、黯淡枯燥，實驗后進行肺 病理學檢查發現其肺組織中有少量炎性細胞，上皮細胞受損呈現纖毛倒伏、粘連；正常大鼠 支氣管黏膜結構和肺組織結構清晰，無上皮壞死脫落、炎細胞浸潤等病理改變，從而證實肺 與皮毛之間確實存在一定的依附關系。而且進行脾病理學切片也提示有形態學改變，從這 幾點來看，可以初步判斷本發明方法可以成功制作氣虛發熱大鼠模型。本發明氣虛發熱動物模型可用于氣虛發熱病癥的中醫臨床辨證論治，還可為中醫 治療氣虛發熱病癥的研究提供平臺。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明通過對大鼠控制飲食以及使其游泳勞損力竭，還有腹腔注射LPS，得到了 氣虛發熱動物模型。研究數據顯示，本發明氣虛發熱動物模型的大鼠眼微睜無神，自主活 動少，對外界反應吃段，逃避、攻擊行為明顯減少；體溫偏高，可高達39.4°C且熱程較長；組 織病理學切片觀察可知氣虛發熱模型的肺局部組織有炎性細胞浸潤，部分出現組織結構模 糊，肺泡間隔變薄或斷裂。因此本發明方法得到的大鼠氣虛發熱模型與現有的氣虛發熱模 型相比，氣更不足，氣虛癥候更加明顯，且通過LPS誘導的發熱癥狀與傳統中醫學癥候所致 發熱相似，是較經典的發熱模型，因此本發明大鼠氣虛發熱模型的氣虛發熱癥狀更顯著，為中醫治療氣虛發熱病癥提供了良好的研究平臺。


圖1是正常組大鼠的行為學觀察；
圖2是氣虛組大鼠的行為學觀察；
圖3是氣虛發熱組大鼠的行為學觀察；
圖4是腹腔注射LPS后大鼠提問升高(AT)的影響(°C)
圖5是正常組大鼠肺臟的病理切片圖6是氣虛組大鼠肺臟的病理切片圖7是氣虛發熱組大鼠肺臟的病理切片圖8是正常組大鼠脾臟的病理切片圖9是氣虛組大鼠脾臟的病理切片圖10是氣虛發熱組大鼠脾臟的病理切片圖。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1氣虛發熱動物模型的制備1.實驗動物SD大鼠，220 250g，SPF級，雌雄各半，廣州中醫藥大學實驗動物中 心提供[合格證號:SCXK粵20080020]。2.藥品和試劑脂多糖 LPS(Escherichcacoliell-dotoxin 055 :B5，L2880)購于 Sigma公司；PGE2、cAMP放免藥盒廣州威佳試劑有限公司；電腦數字溫度計MC-3B型，由 0MR0M歐姆龍(大連)有限公司生產。3.實驗方法將30只SD大鼠隨機分為正常組、氣虛組、氣虛發熱組，每組10只。正 常組常規飼養，自由飲食，其余兩組控制飲食(喂食量為平時的1/2)并進行力竭游泳，水溫 控制在25°C，盛于塑料水桶中。大鼠游泳時，不能以尾撐在池底休息，1次/天，持續21天， 建立氣虛動物模型(本實驗參照MCARDLE推薦的力竭判斷標準(田道法，唐發清，周小軍， 等.氣虛證模型大鼠反義DNA陣列A區基因表達譜特征的初步研究[J].湖南中醫學院學 報，2001,21 (2) 1-3.)，即游泳最后下沉，經10s后仍不能返回水面為力竭)，氣虛發熱組大 鼠腹腔注射LPS(LPS 80 u g/kg)，正常組、氣虛組不做處理。實驗過程中隔天記錄大鼠體重， 并對大鼠行為學進行觀察；取大鼠下丘腦組織，采用ELISA法定量測定PGE2、cAMP含量；取 出脾、肺進行病理學檢查。實施例2氣虛發熱動物模型的行為學觀察對各組大鼠的精神狀態，反應敏捷度，糞便體積大小，排便次數等日常活動進行觀察。結果正常組大鼠表現靈活，眼光有神，反應迅速，被毛潔白光澤，糞便體積大，排 便次數少。氣虛和氣虛發熱模型組大鼠眼微睜無神，自主活動少，對外界反應遲鈍，逃避、攻 擊行為明顯減少，被毛稀疏易脫落、黯淡枯燥，糞便體積小而稀，排便次數少(圖1 3)。實施例3氣虛發熱動物模型的體重變化
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實驗過程中隔天記錄大鼠體重。結果正常組大鼠體重逐漸增長，氣虛和氣虛發熱模型組大鼠體重隨著造模時間 的延長顯著下降，與正常組相比有統計學意義(P < 0. 05或P < 0. 01)。結果見表1。表1大鼠體重的變化(g) (n = 10,x±s ) 注與正常組比較*P< 0. 05，**P < 0. 01 ；實施例4氣虛發熱動物模型的體溫變化造模前2d，每日早晚測量各組大鼠肛溫，選取體溫在36. 6 38. 0°C，且連續體 溫變化<0.3°C的大鼠，取其平均值作為正常基礎體溫CU ；造模后，每隔30min測定肛溫 ⑴)，連續測量8h，計算體溫變化值A T ( A T = T.-To)。從圖4可以看出，與正常組相比，氣虛組和氣虛發熱組大鼠在注射LPS(80ii g/kg) 后的0.5h到8h內各個觀察點AT明顯升高，在統計學上有顯著性差(P<0.05)；氣虛組在 整個實驗過程中的基礎體溫都偏高，并在1. 5h左右達到最高溫度38. 5°C，此后在小范圍內 波動；氣虛發熱組在注射LPS 2. 5h后，體溫有大幅的升高，與氣虛組相比有顯著性差異(P <0. 05)，第5h左右體溫達到高峰39. 4°C，此后逐漸下降，但下降的幅度不明顯，熱程較長， 達8h以上；正常組大鼠體溫相對穩定，始終保持在正常體溫內波動。實施例5氣虛發熱動物模型的下丘腦組織中PGE2和cAMP含量變化的檢測由表2可以看出，氣虛發熱組大鼠下丘腦中cAMP、PGE2含量明顯高于正常組，有非 常顯著的統計學差異(P<0.01)。結果顯示下丘腦組織中CAMP含量升高，推測可能由于 Ca2+濃度下降(Na7Ca2+上升)所引起發熱介質增多而導致的，因此測定下丘腦內Na+/Ca2+值 將為探討其機制的提供更有力的證據。本實驗結果亦表明腹腔注射LPS引起降溫的同時， 下丘腦中PGE2含量降低，提示其可能通過抑制PGE2的分泌過程來降低體溫。表2下丘腦組織中PGE2和cAMP含量(n = 10，) 注與氣虛組比較，*p <0.01。實施例6氣虛發熱動物模型組織病理學切片觀察組織病理學切片檢查實驗結束后斷頭處死，取脾、肺放入10體積％福爾馬林溶 液中固定，24h后經乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、切片、HE染色后放入電鏡下觀察。圖5 7為大鼠肺臟病理切片圖，可以看出，正常組大鼠肺組織結構正常，肺組織 結構清晰，肺泡及肺間隔均未見明顯形態學改變，氣虛和氣虛發熱組大鼠肺局部組織有炎 細胞浸潤，部分出現組織結構模糊，肺泡間隔變薄或斷裂。圖8 10為大鼠脾臟病理學切片圖，從圖可以看出，與正常組相比，氣虛和氣虛發 熱組大鼠脾臟局部組織有炎細胞浸潤，部分出現組織結構模糊。
權利要求
一種氣虛發熱動物模型，其特征在于是采用游泳勞損法加限食法得到大鼠氣虛發熱模型。
2.權利要求1所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于包括如下步驟將大鼠 控制飲食并力竭游泳，腹腔注射LPS。
3.根據權利要求2所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于所述控制飲食是將 大鼠的喂食量降為常規飲食量的1/2 1/3。
4.根據權利要求2所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于所述大鼠力竭游泳 時，不能以尾撐在底部休息，持續游泳到下沉，經IOs后仍不能返回水面為止，每天游泳1 2次，持續3 4周。
5.根據權利要求4所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于所述大鼠力竭游泳 時的水溫為18 25°C。
6 根據權利要求2所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于所述腹腔注射LPS 的量為60 100μ g/kg。
7.根據權利要求6所述氣虛發熱動物模型的制備方法，其特征在于所述腹腔注射LPS 的量為80 μ g/kg。
8.權利要求1所述氣虛發熱動物模型的應用，其特征在于所述氣虛發熱動物模型為中 醫治療氣虛發熱病癥的研究提供平臺。
全文摘要
本發明公開了一種氣虛發熱動物模型及其制備方法和應用。本發明氣虛發熱動物模型是采用游泳勞損法加限食法得到的大鼠氣虛發熱模型。本發明氣虛發熱動物模型的制備方法如下將大鼠控制飲食并力竭游泳，腹腔注射LPS。本發明氣虛發熱動物模型可以用于氣虛發熱病癥的中醫臨床辨證論治，還可為中醫治療氣虛發熱病癥的研究提供平臺。
文檔編號A61D7/00GK101849526SQ20101018641
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者唐曉峰, 王暉, 程闊菊, 薛漫清, 陳懇 申請人:廣東藥學院