專利名稱：一種抗蟲基因OsRG1及其編碼產物與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別地，涉及一種抗蟲基因OsRGl及其編碼產物與應用。
背景技術：
隨著全球人口的增加和耕地面積的減少，人們對糧食單產的要求越來越高。蟲害 造成的糧食損失一般約占糧食總產量的10-30%，重災年份則顆粒無收，因此如何減少蟲害 以增加糧食總產量，是人們面臨的迫切問題。培育抗性品種是減少害蟲危害的一個重要措 施。稻飛虱屬于同翅目飛虱科，主要包括褐飛虱Nilaparvata lugens (StAl)、白背飛 虱Sogatella furcifera等，是我國水稻上的最重要害蟲之一。近幾年來，則為稻飛虱主要 種類之一的褐飛虱，更是年年大暴發，對我國水稻糧食生產造成了嚴重危害。據浙江省農業 廳調查統計，2005年浙江省第5代褐飛虱發生量每667m2達30萬頭以上的有66. 7萬hm2， 占水稻總種植面積的86% ；每667m2在100萬頭以上的有33. 3萬hm2，占42% ；最高田塊的 發生量達到每667m21000萬頭以上；絕收的面積達5333hm2，造成直接水稻產量損失120萬 噸。造成褐飛虱近幾年來特大爆發的一個重要原因，是目前生產上缺乏抗稻飛虱的水稻品 種。因此，發掘抗稻飛虱基因，培育抗稻飛虱品種，將是控制稻飛虱危害的一個重要方面。至今，國內外已在水稻抗稻飛虱基因鑒定與定位等方面取得了很大成績。至今已 命名了 13個抗褐飛虱的主基因，并對其中的8個進行了染色體定位；此外，也鑒定和定位了 10多個抗褐飛虱的數量形狀基因座(QTL)。對抗白背飛虱的主基因已命名了 6個，并對其 中的2個進行了定位；同時，也有10多個抗白背飛虱的數量形狀基因座被鑒定和定位。然 而，至今為止，國內外尚沒有克隆到水稻的抗稻飛虱基因。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種抗蟲基因OsRGl及其編碼產物
與應用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種抗蟲基因OsRGl，它具有SEQ ID No. 1的DNA序列。一種權利要求1所述抗蟲基因OsRGl的編碼蛋白，它包含SEQ ID No. 2的氨基酸 序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經過一個或多個氨基酸殘基的取 代、缺失或者添加且具有與SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No. 2衍 生的蛋白質。一種權利要求1所述抗蟲基因OsRGl在轉基因植物中的應用。一種權利要求1所述抗蟲基因OsRGl在作物育種中的應用。本發明的有益效果是，本發明利用SSH方法和基因芯片技術分析了水稻在害蟲為 害后的差異表達基因，結合RT-PCR和RACE技術分離獲得了 OsRGl基因；以OsRGl基因片段合成同位素探針，應用Northern雜交方法分析了 OsRGl基因在飛虱為害后的表達情況；利 用轉基因技術驗證了 OsRGl基因的生物學功能，發現OsRGl基因在水稻對稻飛虱的抗性中 發揮著重要作用。該基因的分離克隆，對于作物的抗蟲育種，尤其對水稻的抗稻飛虱育種將 起到重要的促進作用。


圖1是OsRGl基因特異PCR擴增產物凝膠電泳圖；圖2是pMD-19-OsRGl酶切鑒定凝膠電泳圖；圖3是水稻受稻飛虱為害后OsRGl基因的表達情況電泳圖；圖4是OsRGl基因的結構示意圖；圖5是含OsRGl基因的水稻遺傳轉化質粒T-DNA框結構示意圖；圖6是OsRGl基因表達減少稻飛虱的產卵量；圖7是OsRGl基因表達明顯增強對稻飛虱的抗性。
具體實施例方式本發明利用差減雜交技術SSH，結合基因芯片檢測技術，分析了水稻在害蟲為害后 所誘導的差異表達基因。從SSH克隆庫中分析獲得OsRGl基因片段，以此片段設計正向和 反向引物，分別進行3，-RACE和5，-RACE RP-PCR獲得了該基因的5，端和3，端基因PCR 片段，并直接測序拼接。根據基因測序拼接獲得DNA序列，在5’端和3’端非編碼區重新設 計一對引物OsRGl-Fl和OsRGl-Rl，提取害蟲為害的水稻葉片mRNA并反轉錄成cDNA，以此 cDNA為模板并以OsRGl-FA和OsRGl-Rl為引物進行常規PCR反應，獲得OsRGl全基因序列 并連接到PMD-T克隆載體測序驗證。Northern雜交結果證明OsRGl在害蟲早期就開始誘導 表達，并且持續相當長的時間，證明OsRGl基因在水稻種起重要作用。通過獲得含OsRGl基 因的水稻轉基因突變體，通過生物測定，證明了 OsRGl是一個重要抗飛虱基因。對該基因的 分離和克隆以及生物學功能的分析，對于作物的抗蟲育種，尤其對水稻的抗稻飛虱育種將 起到重要的促進作用。實現本發明的具體技術步驟如下LOsRGl基因的分離和序列分析利用基因芯片技術和SSH技術分析了水稻在害蟲為害后的差異表達基因，獲得害 蟲為害誘導的特異表達基因克隆庫，并篩選到單克隆LYG22。測序分析發現此克隆并沒有覆 蓋該基因的完整編碼區。為了獲得該片段的完整編碼區序列，我們用3’_RACE和5’-RACE技術擴增該片段 的3’末端和5’末端片段。根據TaKaRa Race試劑盒方法，以害蟲為害水稻葉片mRNA為 模板合成cDNA雙鏈。以該片段正向引物Fl與3’ RACE錨定引物P3配對，反向引物Rl與 5，RACE錨定引物P5配對作常規PCR分別獲得5，RACE PCR片段和3，RACE PCR片段，PCR 片段經PCR片段回收試劑盒純化后，測序得到LYG22的5’末端和3’末端序列信息。以LYG22的5’末端和3’末端序列信息在5’端和3’端非編碼區重新設計一對引 物OsRGl-Fl和OsRGl-Rl，并以上面合成的cDNA雙鏈為模板，PCR擴增后連接入pMD_19T克 隆載體，挑取4個克隆送上海生物工程公司測序，每個分別測通2次。測序結果，用生物信
4息專業DNA拼接軟件Conting 3.1拼接。獲得OsRGl基因DNA序列，見序列表SEQ ID No. 1 表示的序列。根據該序列的開放閱讀框(ORF)，推算出該基因編碼蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2 所示。2. OsRGl基因在害蟲為害后的表達譜分析取水稻經飛虱為害0，1. 5，3，6，12，24，48，72h的莖桿，用Trizol法提取其總RNA, 分別將10 μ g各時間點RNA經甲醛電泳分離后，通過毛細管上吸的方法轉到尼龍膜 上，經紫外交聯固定RNA在膜上。以OsRGl基因片段合成同位素探針，對膜進行雜交分析。 Northern雜交結果證明OsRGl在害蟲為害早期就開始誘導表達，并且持續相當長的時間 (圖 3)。3.構建含OsRGl基因水稻遺傳轉化載體(圖5)。構建的表達載體以電擊法轉化 農桿菌，獲得含有表達載體的工程農桿菌，以本實驗成熟的農桿菌轉基因方法侵染水稻愈 傷，愈傷經抗性篩選后獲得整合了目的基因的愈傷組織，再經分化培養基和生根培養基中 培養，獲得含OsRGl基因轉基因水稻。對水稻植株進行觀察未發現植株生理缺陷，能獲得正 常世代。生物測定試驗表明，稻飛虱成蟲含OsRGl基因水稻上的產卵量明顯減少，如圖6A 和B。稻飛虱抗性實驗表明含OsRGl基因水稻長勢明顯優于對照水稻，接稻飛虱在16天后 對照水稻基本枯死，而含OsRGl基因水稻水稻僅外面的葉片枯黃(圖7)。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明范圍。實施例1、OsRGl cDNA片段的獲得1)水稻莖桿RNA的提取、質量檢測及總cDNA第一鏈合成；2)從總cDNA第一連中以聚合酶鏈式反應(PCR)合成OsRGl cDNA片段上游引物5，-ATCAGGATTTGAGAGAG-3，下游引物5，-ATTCTTGGATTCTATAAAGACCTA-3，PCR 擴增條件95 V X3min — (98 V XlOsec — 68 V X lmin) X 30 循環 —720C X lOmin，得到特異PCR擴增產物見附圖1。3)pMD-19-0sRGl克隆載體構建及基因堿基解析PCR產物通過T克隆入Takara公司pMD-19載體獲得pMD-19-OsRGl載體，并通 過CaCl2法轉入TGl大腸桿菌。pMD-19-OsRGl經EcoRI和PstI酶切鑒定(圖2)后，將含 pMD-19-OsRGl載體的TGl菌液送上海生物工程有限公司測序。用軟件Chromas和Contig 對測序進行拼接獲得序列表中的序列SEQ ID No. 1。將此cDNA的基因命名為OsRGl。實施例2、OsRGl基因表達譜分析-Northern雜交將各種材料的總RNA熒光法定量后，取IOyg各個樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠上 75V電壓電泳60min，在GENE凝膠成像儀成像后，浸泡于0. 05M的NaOH中25min，用DEPC處 理的ddH20淋洗3-4次，放入10倍體積的20X SSC中，溫和搖動45min。用向上毛細管轉移法，使RNA吸附在帶正電的尼龍膜上，經UV交聯儀交聯后，80°C 烘烤120min固定。探針標記按Prime-a-Gene Label ing Syntem(Promega)試劑盒說明書進行。 RPHl基因DNA模板25ng，經95_100°C水浴變性5min，立即放冰上冷卻，按表1要求加入相 應的試劑，加入同位素的操作需在有機屏擋板后進行。25°C反應60min后，95-100°C變性5min,冰上放置5min，備用。表1探針標記反應體系
權利要求
一種抗蟲基因OsRG1，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的DNA序列。
2.—種權利要求1所述抗蟲基因OsRGl的編碼蛋白，其特征在于，它包含SEQID No. 2 的氨基酸序列的蛋白質。或者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經過一個或多個氨基酸 殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No. 2衍生的蛋白質。
3.一種權利要求1和2所述抗蟲基因OsRGl在轉基因植物中的應用。
4.一種權利要求1和2所述抗蟲基因OsRGl在作物育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗蟲相關基因OsRG1其及其編碼產物與應用，該抗蟲基因OsRG1具有SEQ ID No.1的DNA序列。該序列由763個核苷酸堿基組成，包含一個由624個核苷酸構成的完整的編碼框，編碼208個氨基酸殘基的小分子量蛋白。研究發現OsRG1與水稻的抗蟲相關，該基因的表達產物能對褐飛虱起很好的趨避和抗生作用。本發明將在作物育種，特別是在水稻抗蟲育種中得到廣泛應用。
文檔編號A01H5/00GK101967486SQ20101021843
公開日2011年2月9日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者任楠, 周國鑫, 婁永根, 毛碧增, 齊金峰 申請人:浙江大學