專利名稱：一種南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物肥料領域中的微生物肥料技術領域，具體涉及一種南方紅豆杉根 際高效解磷熒光假單胞菌及其應用。
背景技術：
南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei)屬紅豆杉科紅豆杉屬的一個種，是第 四世紀冰川遺留下來的世界珍稀瀕危樹種。1999年國務院批準將其列為國家一級保護珍貴 樹種(于永福，1999)。南方紅豆杉零星分布于黃河以南地區，包括廣東、廣西、四川、重慶、 山西、湖南和臺灣等17個省市區。自上世紀70年代以來，紅豆杉屬植物因可提取特效抗癌活性成分紫杉醇而倍受 世人的關注。紫杉醇是目前世界上最好的抗癌藥物之一。現階段紫杉醇的生產大多利用紅 豆杉屬天然林提供原料，但該屬樹種自然繁殖更新能力較低，野生資源十分稀少，遠遠不能 滿足市場上的需求。由于長期嚴重砍伐，造成南方紅豆杉天然林數量劇減，目前已處于瀕危 狀態(潘標志，2004;王昌騰，2005)。通過營造大面積的南方紅豆杉人工林，能夠有效保護 該珍貴樹種和改善生態環境，滿足目前市場所需和紫杉醇產業的可持續發展。但由于該屬 植物對環境要求較嚴，傳統的人工栽培成活率較低，且生長緩慢遠遠不能滿足市場的需求。 金國慶等(2007)研究發現施用化肥能顯著促進人工營造南方紅豆杉幼林生長。然而，隨著 全球能源危機和化肥使用量的迅速增加，其負面影響日益顯見。因此，探尋新的肥料，尤其 是生物質肥料，以替代或部分替代化肥的研究倍受關注。在營造南方紅豆杉人工林過程中，磷素供應不足是突出而具普遍性的問題。磷是 植物生長發育的必需營養元素之一，但土壤中95%以上的磷素與土壤中Ca2+、Fe2+和Al3+ 等金屬離子結合而喪失有效性。土壤的磷素循環是以微生物活動為中心的，其對土壤磷的 轉化和有效性影響很大。早在20世紀初，人們就開始關注微生物與土壤磷素之間的關系。 Sackett (1908)首次發現一些原本不溶的磷酸鹽和天然磷礦石能被一些細菌所溶解利用。 此后，利用根際微生物對難溶性磷的溶解作用來促進植物生長和改善植物磷營養狀況的研 究得到廣泛開展。研究表明，土壤中存在的某些細菌和部分真菌是最有效的解磷微生物，它們通過 溶解和礦化作用能將土壤中難溶性無機磷和有機磷轉化為有效態磷，供植物所吸收利用 (Whitelaw et al.，1999)。據不完全統計，目前全世界共篩選出30屬89種解磷微生物，其 中對解磷細菌開展的研究較多。解磷細菌作為土壤磷循環中一類重要的微生物，能夠改善 南方紅豆杉的磷素供應，使南方紅豆杉生長的更快、更好。目前，有關南方紅豆杉根際高效 解磷細菌菌株的篩選及應用研究未見報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌。本發明還要解決的一個技術問題是提供上述南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌的應用。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下從山西省長治市長治林業局院內30年生南方紅豆杉根際土壤中，篩選獲得了一 株高效解磷熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CLW17。保藏于中國典型培養物保藏 中心，地址中國.武漢.武漢大學，郵編430072，菌種保藏號CCTCC NO =M 2010158，保藏 日為2010年6月24日。CCTCC NO =M 2010158菌株的主要生物學特征在牛肉膏蛋白胨培養基平 板上，菌落較小，顏色淺黃，圓形、邊緣整齊；菌體直桿狀，革蘭氏染色陰性，大小約 0. 43X0. 64μ m 1. 89X2. OOym,無芽孢，極生一根或三根鞭毛；好氧，氧化酶反應陽 性，接觸酶試驗陽性，淀粉水解陰性，尿酶試驗陽性，精氨酸雙水解酶陽性；發酵葡萄糖， M.R.和吲哚試驗陰性，V. P.試驗陽性；明膠液化陽性，硝酸還原試驗陰性，產氨和硫化氫 試驗陰性，檸檬酸鹽生長試驗陽性；對青霉素不敏感；產熒光色素；不產類胡蘿卜素和膿青 素；在KB培養基平板上培養24h后，菌落在366nm波長紫外光下發綠色熒光，菌體在熒光顯 微鏡下自發熒光。CCTCC NO :M 2010158 菌株 16SrDNA 基因序列，見 SEQ ID No. 1 所示。將所 測16SrDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，結果表明菌株CCTCCN0 M 2010158與假單胞菌屬(Pseudomonas)同源性都很高，與P. fluorescens的相似度為 99%。結合形態、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。CCTCC NO =M 2010158菌株可將土壤中難溶性無機磷轉變為有效態磷供南方紅豆 杉吸收，促進南方紅豆杉生長。有益效果本發明的南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌在液體搖培的情況 下，對難溶性磷酸鹽磷酸三鈣(Ca3 (PO4) 3)、磷酸鐵(FePO4 ·4Η20)、磷酸鋁(AlPO4)、江蘇錦屏 磷礦粉和羥基磷灰石(Caltl(PO4)6(OH)2)具有較強的溶解效果，與對照(CK)相比，差異極顯 著；本發明的南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌制成菌劑接種南方紅豆杉實生苗。結 果表明，該菌劑能明顯促進南方紅豆杉的生長發育，因此，本發明為將來開發南方紅豆杉專 用微生物肥料提供了優良的菌株資源。


熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CLW17，保藏于中國典型培養物保藏中 心，地址中國.武漢.武漢大學，郵編430072，菌種保藏號CCTCC NO =M 2010158，保藏日 為2010年6月24日。圖1為CLW17菌株對難溶性磷酸鹽磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、江蘇錦屏磷礦粉和 羥基磷灰石的溶解能力。
具體實施例方式根據下述實施例，可以使本領域的技術人員更好地理解本發明。實施例所描述的 僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 :CLW17菌株實驗室解磷試驗。
解磷培養基A 葡萄糖 10g, Ca3 (PO4) 35g，MgCl25g，KCl 0. 2g，MgSO4. 7H20 0. 25g， (NH4)2SO4O. lg，蒸餾水 lOOOmL，pH 7. O。解磷培養基B 用羥基磷灰石(Caltl (PO4) 6 (OH) 2)代替解磷培養基A中的Ca3 (PO4) 3， 其它成分和含量相同。解磷培養基C 用磷酸鐵(FePO4 · 4H20)代替解磷培養基A中的Ca3 (PO4) 3，其它成 分和含量相同。解磷培養基D 用磷酸鋁(AlPO4)代替解磷培養基A中的Ca3 (PO4)3，其它成分和含 量相同。解磷培養基E 用江蘇錦屏磷礦粉代替解磷培養基A中的Ca3 (PO4) 3，其它成分和含 量相同。將活化的CLW17菌株接種NA培養基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)中，28°C振蕩培養18 24h作為種子液，將種子液按1% (ν/ν)接 種量分別接種到裝有50mL解磷培養基A、B、C、D和E的IOOmL三角瓶中，以接相同體積空 白種子液的解磷培養基為對照(CK)，每個處理三個重復，280C，180r/min培養3d后，發酵液 4°C，10000r/min離心lOmin，鉬銻抗比色法測定發酵液中可溶性磷含量，結果見圖1。從圖1中可以得出，分別以難溶性磷酸鹽磷酸三鈣(Ca3(PO4)3)、磷酸鐵 (FePO4 ·4Η20)、磷酸鋁(AlPO4)、江蘇錦屏磷礦粉和羥基磷灰石(Caltl(PO4)6(OH)2)為唯一磷 源，培養3d后，CLW17發酵液中可溶性磷含量均高于對照。以上表明，菌株JW-JSl對五種 難溶性磷源均具有較強的溶解能力。實施例2 =CLff 17溫室盆栽試驗將菌株CLW17活化后，用接種環挑取少量菌體接種于裝有50mLNA培養基(牛肉膏 3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)的IOOmL三角瓶中，29°C，200r/ min振蕩培養48h。發酵液(4°C，6000r/min)離心5min，無菌生理鹽水潤洗菌體3次后，無 菌生理鹽水調節菌懸液(IO8CfuAiL)制成接種劑。接種南方紅豆杉(苗齡60天)，以等量 無菌生理鹽水為對照，接種量為實生苗5mL/株。每處理6個重復，置于溫室統一管理，光照 為12h/天，適時澆水。南方紅豆杉接種后150天生長情況見表1，可以看出，接種CLW17能夠顯著促進南 方紅豆杉實生苗的生長。與對照(CK)相比，接種CLW17的處理在苗高和莖粗上的增長率分 別達到了 18. 45%和7. 54%，促生效果顯著。表1CLW17對南方紅豆杉實生苗生長的影響 注P < 0. 05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著
權利要求
一種南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CLW17，已保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC NOM 2010158，保藏日為2010年6月24日。
2.權利要求1所述的南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌在促進南方紅豆杉生長 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CLW17，已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM 2010158。本發明還公開了上述南方紅豆杉根際高效解磷熒光假單胞菌在南方紅豆杉促生長中的應用。本發明菌株在液體搖瓶培養的情況下，對難溶性磷酸鹽磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、江蘇錦屏磷礦粉和羥基磷灰石具有較強溶解效果；該菌株制成菌劑分別接種于南方紅豆杉扦插苗和實生苗，結果表明，該菌劑能明顯促進兩者的生長發育。因此，本發明能為將來開發南方紅豆杉專用微生物肥料提供優良的菌株資源。
文檔編號C05F11/08GK101899409SQ20101022124
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者任嘉紅, 劉瑞祥, 劉輝, 金山, 韓明躍 申請人:長治學院