專利名稱：同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法
技術領域：
本發明涉及藥用植物育種領域，具體來說，涉及一種珍稀民族藥天山雪蓮同源四 倍體植株的培育方法。
背景技術：
天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar et Kir.)系菊科鳳毛菊屬多年生一次性 開花結實大型草本植物，又名雪蓮花或荷蓮，是國家三級瀕危保護種、新疆特有分布種。生 長于海拔2400 4100m處的亞高山和高山懸崖陡壁之上、冰漬巖縫之中。為新疆特有的珍 奇名貴中草藥和高山花卉，具有重要的藥用和觀賞價值。雪蓮耐低溫、抗風寒，生長環境極 為嚴酷、自然繁殖率低(野生環境下，種子萌發率不到5% )、生長周期長且人工栽培困難。 目前，適宜雪蓮生存的種群分布范圍也隨著全球氣候變暖而日益縮小，人為的過度濫挖亂 采，致使野生雪蓮資源日益匱乏，物種瀕臨滅絕。天山雪蓮生長期長達5 8年，根、莖、葉富含具有藥用活性的次生代謝產物如生 物堿、黃酮類、揮發油、內脂、留體類、多糖等，其花蕾更富含微量元素和氨基酸等，具有活血 通絡、散寒除濕、抗炎鎮痛、抗疲勞、終止妊娠以及滋陰壯陽等功效。多倍體植物由于染色體 加倍，往往具有器官的巨大性，即根莖葉的產量較高，能較好地滿足藥材生產的要求；另一 方面，植物染色體倍性的變化，也往往會導致次生代謝產物含量的變化，有可能獲得有效成 分含量高的藥用植物。同時多倍體植株生態適應性及對逆境的抗性也有所增強。近年來， 對天山雪蓮的研究大多集中在生理、有效藥用成分、藥理以及基因工程等方面，關于其多倍 體育種卻研究甚少。因此，從根本上解決藥用植物天山雪蓮的品種選育，不僅對于促進人工 道地性種植產業的推廣和發展，而且對于高山瀕危藥用植物的保護、開發和利用都具有非 常重要的意義。單倍體是指體細胞中含有本物種配子染色體數的生物個體。而一倍體是指體細胞 含一個染色體組的個體。絕大多數生物為二倍體生物，其單倍體的體細胞中含一個染色體 組，如果原物種本身為多倍體，那么它的單倍體的體細胞中含有的染色體組數一定多于一 個。如四倍體水稻的單倍體含兩個染色體組，六倍體小麥的單倍體含三個染色體組。多倍 體就是指體細胞中含有三個以上染色體組的生物個體。同源多倍體是由原來的染色體組加 倍形成的多倍體。鑒于此，在進行同源四倍體天山雪蓮植株的培育過程中，就要確實保證細 胞內的染色體數呈整數加倍，而不是單單指染色體數的簡單增多，否則得到的多倍體只是 雜合體(染色體數不規律增加)或嵌合體(含有不同倍性的各種細胞)，而且此類多倍體在 繼代增殖過程中往往會發生回復突變，且性狀不穩定。為了得到純合同源四倍體天山雪蓮 植株，本發明在2007100089255. X基礎上進行了大幅度改進。在優化種子表面消毒方法、四 倍體植株誘導條件特別是處理溫度及后期增殖溫度的嚴格控制、改用莖尖生長點為材料進 行染色體壓片、利用先進準確的DNA含量流式細胞儀檢測技術等方面做了細化和改進，并 成功實現組培四倍體植株的溫室移栽，通過大量實驗摸索出了一套培育純合同源四倍體天 山雪蓮植株的實驗方法。
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此外，本發明還結合雪蓮無菌苗快速誘導叢生芽與增殖技術，利用秋水仙素處理 下胚軸莖段使再生植株染色體加倍，誘導產生四倍體天山雪蓮植株，結合形態學、解剖學、 染色體壓片以及流式細胞儀技術篩選鑒定具有優良性狀且生物量和藥用成分均有所提高 的四倍體植株?？梢钥朔焐窖┥徳谧匀环敝澈腿斯しN植中出現的品種退化問題，對于擴 大新疆特有珍稀藥用植物種植面積，提高天山雪蓮種植收入，滿足市場需求以及推廣常用 中藥開發利用有重要意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法。該方法利用切 除根、葉后的天山雪蓮無菌苗的下胚軸莖段為外植體，通過含有不同濃度秋水仙素的固體 培養基進行誘導處理，誘導產生四倍體天山雪蓮植株，通過改變染色體倍性使植株產生優 良性狀以提高其生物量及藥用成分的含量，通過四倍體的篩選鑒定得到四倍體天山雪蓮。 該方法提供了誘導四倍體產生的有效秋水仙素濃度、處理時間、處理溫度以及用于四倍體 鑒定的形態學、染色體計數和流式細胞儀的改進方法。通過此方法可快速實現同源四倍體 天山雪蓮植株的培育，進而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪蓮在自然繁殖和人工 種植中出現的品種退化問題。發明所述的一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法，按下列步驟進行a、將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75%乙醇表面消毒20-50seC，然后用 15% H2O2溶液消毒15-50min，將消毒后的種子用無菌水漂洗2-5次，再播種于MS培養基上， 每瓶MS培養基播種10-30粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；b、將步驟a中萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；C、將步驟b中下胚軸莖段接種于添加有2%二甲基亞砜和濃度為0-0. 20%秋水仙 素的出芽誘導培養基上處理l-3d，培養溫度25-30°C，光照強度50μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時 間 16h · cf1，出芽誘導培養基為 MS+BA0. 3-0. 5mg/L+TDZ0. 3-0. 5mg/L+NAA0. 05-0. lmg/L ；d、將步驟C中處理過的下胚軸蓮段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/ L增殖培養基中培養25-30d，培養溫度20 士 1°C，光照強度50μπιΟ1 ·πΓ2 · s—1，光照時間 16h · cf1 ；e、將步驟d中增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. 05-0. 2mg/L生根培養基中 生根；f、天山雪蓮同源四倍體的篩選將步驟e中的植株與二倍體對照植株做對比分 析，根據二者在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度 之間的差異，初步確定為同源四倍體植株；g、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取步驟e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不 定芽莖尖組織，在溫度0-4°C，經過0. 002mol/L 8-羥基喹啉預處理或飽和對二氯苯水溶液 預處理，卡諾固定液固定，溫度60°C，l-2mol/L鹽酸解離6-15min，改良苯酚品紅染色液染 色10-15min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖尖染色體，初步確定為同源四倍體植株；h、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二 隨機剪取步驟e中部分植株的葉片，于常 溫下在裝有3-5ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾， 500-1000r · HiirT1離心漂洗3次，流式細胞儀檢測確定為同源四倍體植株；
i、天山雪蓮同源四倍體的移植將步驟e中培育的植株洗去根部附著的殘留培養 基，定植于草炭土珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通 風一次，每次30min，每兩天澆水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養，天山 雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達82%。步驟c、d和e中的培養基均為固體培養基。步驟g中8-羥基喹啉預處理時間為2_6h，飽和對二氯苯水溶液預處理時間為 5-10h，卡諾固定液固定時間為12-36h。步驟i溫室苗床濕度為60%，溫室培養溫度控制在20-22°C。本發明所述同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法優點為消毒方法的改進。實驗室種子表面消毒是為了保證材料在培養過程中不污染。而 以前的消毒方法大多采用了 HgCl2，這對于藥用植物來說往往會造成Hg離子的毒害和殘留， 廢液也會引起環境重金屬污染等，使用HgCl2消毒也會使種子萌發率降低。而過氧化氫的 漂白作用對于雪蓮種子特有的褶皺表皮結構有顯著消毒效果，改進后的兩步消毒法節省了 時間，減少了 Hg的污染，保護了環境。此外，將種子消毒前使用流水沖洗改用溫水浸泡還可 以達到節約水資源等成本的目的。誘導方法的選擇。天山雪蓮是多年生草本，種子量少且獲取非常艱難。在試驗田 用浸種法、涂抹法等途徑處理雪蓮種子和種子苗，效果均不理想，也未獲得純合四倍體，而 且還受季節的限制。在實驗室中，用附加秋水仙素的固體培養基萌發天山雪蓮種子，容易得 到變異苗，但是多為畸形苗，后期存活率低。同時這種新萌發的苗較為脆弱，對秋水仙素的 毒害作用敏感。而采用本發明將處理生長一段時間后的無菌苗經誘導獲得四倍體的效果更 好，在處理期間適當升高溫度(25 30°C )可使誘導率顯著提高，而在增殖階段則需要適 當低溫(20士 1°C )，通過溫度的調控可使四倍體再生植株形態差異顯著，誘變率高。方法可 行、篩選工作量小。倍性鑒定方法的選擇。植物形態變化鑒定四倍體最簡便、也最粗略，可用于變異株 的初篩；氣孔所表現出來的較大性可作為鑒定四倍體的重要標準；然而外觀形態的變化僅 能說明植株可能發生了變異，要想更準確無誤地判斷其倍性還需染色體及DNA含量分子水 平方面的證據。本發明在早期形態和氣孔觀察的基礎上，再結合染色體計數和流式細胞儀 對誘導得到的四倍體植株進行綜合鑒定，易于操作，結果準確可靠。四種不同的倍性鑒定方 法還可以在增殖擴繁、誘導篩選的各個組織培養階段同時進行，保證了所得四倍體材料的 準確定性，特別是將流式細胞儀技術引入珍稀藥用植物的倍性育種和鑒定中，可以實現對 四倍體材料的適時跟蹤檢測，針對性強、效率高。染色體倍性鑒定方法的選擇。對誘變所得植株采用染色體計數進行倍性檢測中， 多圍繞根尖、組培芽、愈傷、花粉、胚乳等材料進行了鑒定。但天山雪蓮是多年生一次性開花 結實草本植物，要實現對誘導苗的適時跟蹤檢測，組培芽和根尖無疑是最理想的材料。雪蓮 幼苗葉片基生，只有一個生長點部位，用組培芽切除后進行壓片，都會對篩選得來的珍貴材 料造成浪費，而將其培育到生根階段再進行壓片，則周期較長，這對于藥用植物育種來說是 非常不利的。本發明利用下胚軸莖段生長點成功觀察到染色體，實現了對多倍體天山雪蓮 苗生長過程染色體數的有效、快速檢測。


圖1為本發明萌發天山雪蓮無菌苗的種子外觀形態圖。圖2為本發明切除根、葉留下的下胚軸莖段圖。圖3為本發明二倍體與四倍體表型比較圖，其中al、bl、cl為二倍體；a2、b2、c2為 四倍體，a為葉片、b為根、c為整株。圖4為本發明二倍體a與四倍體b氣孔比較圖。圖5為本發明二倍體染色體a與四倍體染色體b圖。圖6為本發明二倍體a與四倍體b e DNA相對含量曲線比較圖。
具體實施例方式實施例1 將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用濃度75%乙醇表面消毒20sec，然后用 15% H2O2溶液消毒15min，將消毒后的種子用無菌水漂洗3次，再播種于MS培養基上，每瓶 MS培養基播種10粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；種子萌發率為73. 3% (正常發芽種子數/參試種子總數)。將萌發生長的無菌苗切除根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；將下胚軸莖段接種到添加有2 % 二甲基亞砜的誘導出芽培養基MS+BA0. 3mg/ L+TDZO. 3mg/L+NAA0. 05mg/L中處理3d (對照)，培養溫度25-30 °C，光照強度 50 μ mol · πΓ2 · S、光照時間 16h · cf1 ；將處理過的下胚軸莖段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L增殖培養基 中培養25d，培養溫度20士 1°C，光照強度50 μ mol · m_2 · s—1，光照時間16h · cf1 ；將增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. lmg/L生根培養基中生根；天山雪蓮同源四倍體的篩選將疑似株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者 在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異， 初步確定其為二倍體；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取對照組幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖等 組織，在4°C下，經過0. 002mol/L 8-羥基喹啉預處理4h，卡諾固定液固定24h，溫度60°C， lmol/L鹽酸解離lOmin，改良苯酚品紅染色液染色15min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽 莖尖染色體，初步確定染色體為2η = 2x = 32，為二倍體植株；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取對照組幼嫩葉片，于常溫下在裝有 3ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，IOOOr · mirT1離心 漂洗3次，流式細胞儀檢測確定植株二倍體的熒光通道值PI為300 ；天山雪蓮同源四倍體的移植將培育的植株洗去根部附著的殘留培養基，定植于 草炭土 珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每 次30min，每兩天澆水一次，濕度60 %，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養溫度 控制在22°C，天山雪蓮植株煉苗移栽成活率達90% ；不定芽存活率100%，多倍體的誘導率0% (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)。實施例2 將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用濃度75%乙醇表面消毒20sec，然后用
6，將消毒后的種子用無菌水漂洗2次，再播種于MS培養基上，每瓶 MS培養基播種15粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；種子萌發率為73. 3% (正常發芽種子數/參試種子總數)。將萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；將下胚軸莖段接種到均添加有2%二甲基亞砜和0.05%秋水仙素的誘導出芽 培養基 MS+BAO. 3mg/L+TDZ0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L 中處理 3d，培養溫度 25 °C，光照強度 50 μ mol · πΓ2 · S、光照時間 16h · cf1 ；將處理過的下胚軸莖段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L增殖培養基 中培養25d，培養溫度20士 1°C，光照強度50 μ mol · m_2 · s—1，光照時間16h · cf1 ；將增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. 05mg/L生根培養基中生根；天山雪蓮同源四倍體的篩選將疑似株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者 在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異， 初步確定其為四倍體；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖等 組織，在4°C下，經過0. 002mol/L 8-羥基喹啉預處理2h，卡諾固定液固定12h，溫度60°C， lmol/L鹽酸解離6min，改良苯酚品紅染色液染色lOmin，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖 尖染色體，染色體確定為2η = 4x = 64為四倍體植株；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取對照組幼嫩葉片，于常溫下在裝有 4ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，500r · min^1離心 漂洗3次，流式細胞儀檢測確定植株四倍體的熒光通道值PI為600 ；天山雪蓮同源四倍體的移植洗去四倍體植株根部附著的殘留培養基，定植于草 炭土珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次 30min,每兩天澆水一次，濕度60%，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養溫度控制 在20°C，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達78%。不定芽存活率達56 %，多倍體的誘導率27 % (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)。實施例3 將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75%乙醇表面消毒30sec，然后用15% H2O2溶液消毒30min，將消毒后的種子用無菌水漂洗4次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培 養基播種20粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；種子萌發率為75% (正常發 芽種子數/參試種子總數)。將萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；將下胚軸莖段接種到添加有2% 二甲基亞砜和0. 10%秋水仙素的誘導出芽 培養基 MS+BAO. 4mg/L+TDZ0. 4mg/L+NAA0. 08mg/L 中處理 2d，培養溫度 28 °C，光照強度 50 μ mol · πΓ2 · S、光照時間 16h · cf1 ；將處理過的下胚軸莖段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L增殖培養基 中培養28d，培養溫度20士 1°C，光照強度50 μ mol · m_2 · s—1，光照時間16h · cf1 ；將增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. lmg/L生根培養基中生根；天山雪蓮同源四倍體的篩選將疑似株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者 在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異，
7初步確定其為四倍體；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖等 組織，在4°C下，經過飽和對二氯苯水溶液預處理5h，卡諾固定液固定24h，溫度60°C，2mol/ L鹽酸解離lOmin，改良苯酚品紅染色液染色13min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖尖染 色體，染色體確定為2η = 4x = 64為四倍體植株；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取疑似株幼嫩葉片，于常溫下在裝有 3ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，IOOOr ^irT1離心 漂洗3次，流式細胞儀檢測確定植株四倍體的熒光通道值PI為600 ；天山雪蓮同源四倍體的移植洗去四倍體植株根部附著的殘留培養基，定植于草 炭土珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次 30min,每兩天澆水一次，濕度60%，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養溫度控制 在21. 5°C，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達85%。不定芽存活率43 %，多倍體的誘導率達61 % (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)。實施例4 將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用濃度75%乙醇表面消毒40sec，然后用 15% H2O2溶液消毒40min，將消毒后的種子用無菌水漂洗5次，再播種于MS培養基上，每瓶 MS培養基播種30粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；種子萌發率為86. 4% (正常發芽種子數/參試種子總數)；將萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；將下胚軸莖段接種到添加有2% 二甲基亞砜和0. 15%秋水仙素的誘導出芽 培養基MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L中處理ld，培養溫度30°C，光照強度 50 μ mol · πΓ2 · S、光照時間 16h · cf1 ；將處理過的下胚軸莖段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L增殖培養基 中培養30d,培養溫度20士 1°C，光照強度50 μ mol · m_2 · s—1，光照時間16h · cf1 ；將增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. 15mg/L生根培養基中生根；天山雪蓮同源四倍體的篩選將疑似株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者 在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異， 初步確定其為四倍體；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖等 組織，在4°C下，經過0. 002mol/L 8-羥基喹啉預處理6h，卡諾固定液固定36h，溫度60°C， 1. 5mol/L鹽酸解離12min，改良苯酚品紅染色液染色15min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定 芽莖尖染色體，染色體確定為2η = 4x = 64為四倍體植株；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取疑似株幼嫩葉片，于常溫下在裝有 5ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，IOOOr ^irT1離心 漂洗3次，流式細胞儀檢測確定植株四倍體的熒光通道值PI為600 ；天山雪蓮同源四倍體的移植洗去四倍體植株根部附著的殘留培養基，定植于草 炭土珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次 30min,每兩天澆水一次，濕度60%，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養溫度控制 在21°C，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達74%。
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不定芽存活率35%，多倍體的誘導率49% (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)。實施例5 將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75 %乙醇表面消毒50sec，然后用15% H2O2溶液消毒50min，將消毒后的種子用無菌水漂洗2次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培 養基播種25粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；種子萌發率為55. (正常 發芽種子數/參試種子總數)。將萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；將下胚軸莖段接種到添加有2%二甲基亞砜和0.20%秋水仙素的誘導出芽 培養基 MS+BAO. 3mg/L+TDZ0. 4mg/L+NAA0. 08mg/L 中處理 ld，培養溫度 29 °C，光照強度 50 μ mol · πΓ2 · S、光照時間 16h · cf1 ；將處理過的下胚軸莖段轉入MS+BAO. 5mg/L+TDZ0. 5mg/L+NAA0. lmg/L增殖培養基 中培養30d,培養溫度20士 1°C，光照強度50 μ mol · m_2 · s—1，光照時間16h · cf1 ；將增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0. 2mg/L生根培養基中生根；天山雪蓮同源四倍體的篩選將疑似株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者 在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異， 初步確定其為四倍體；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖 等組織，在4°C下，經過飽和對二氯苯水溶液預處理10h，卡諾固定液固定20h，溫度60°C， 2mol/L鹽酸解離8min，改良苯酚品紅染色液染色13min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖 尖染色體，染色體確定為2η = 4x = 64為四倍體植株；天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取疑似株幼嫩葉片，于常溫下在裝有 4ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，900r · min^1離心 漂洗3次，流式細胞儀檢測確定植株四倍體的熒光通道值PI為600 ；天山雪蓮同源四倍體的移植洗去四倍體植株根部附著的殘留培養基，定植于草 炭土珍珠巖蛭石=3 1 1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次 30min,每兩天澆水一次，濕度60%，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養溫度控制 在20. 5°C，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達70%。不定芽存活率40%，多倍體的誘導率33% (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)。
權利要求
一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法，其特征在于按下列步驟進行a、將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20 50sec，然后用15％H2O2溶液消毒15 50min，將消毒后的種子用無菌水漂洗2 5次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10 30粒種子，7 15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；b、將步驟a中萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；c、將步驟b中下胚軸莖段接種于添加有2％二甲基亞砜和濃度為0 0.20％秋水仙素的出芽誘導培養基上處理1 3d，培養溫度25 30℃，光照強度50μmol·m 2·s 1，光照時間16h·d 1，出芽誘導培養基為MS+BA0.3 0.5mg/L+TDZ0.3 0.5mg/L+NAA0.05 0.1mg/L；d、將步驟c中處理過的下胚軸莖段轉入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培養基中培養25 30d，培養溫度20±1℃，光照強度50μmol·m 2·s 1，光照時間16h·d 1；e、將步驟d中增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0.05 0.2mg/L生根培養基中生根；f、天山雪蓮同源四倍體的篩選將步驟e中的植株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異，初步確定為同源四倍體植株；g、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一隨機剪取步驟e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖組織，在溫度0 4℃，經過0.002mol/L 8 羥基喹啉預處理或飽和對二氯苯水溶液預處理，卡諾固定液固定，溫度60℃，1 2mol/L鹽酸解離6 15min，改良苯酚品紅染色液染色10 15min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖尖染色體，初步確定為同源四倍體植株；h、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二隨機剪取步驟e中部分植株的葉片，于常溫下在裝有3 5ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，500 1000r·min～1離心漂洗3次，流式細胞儀檢測確定為同源四倍體植株；i、天山雪蓮同源四倍體的移植將步驟e中培育的植株洗去根部附著的殘留培養基，定植于草炭土∶珍珠巖∶蛭石＝3∶1∶1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次30min，每兩天澆水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達82％。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c、d和e中的培養基均為固體培養基。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟g中8-羥基喹啉預處理時間為2-6h， 飽和對二氯苯水溶液預處理時間為5-10h，卡諾固定液固定時間為12-36h。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟i溫室苗床濕度為60%，溫室培養溫 度控制在20-22 °C。
全文摘要
本發明涉及一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法。該方法利用切除根、葉后的天山雪蓮無菌苗的下胚軸莖段為外植體，通過含有不同濃度秋水仙素的固體培養基進行誘導處理，誘導產生四倍體天山雪蓮植株，運用四倍體的篩選鑒定技術鑒定所得四倍體天山雪蓮。該方法提供了誘導四倍體產生的最佳秋水仙素濃度、處理時間、處理溫度以及用于四倍體鑒定的形態學、染色體計數和流式細胞儀的改進方法。通過此方法可快速實現同源四倍體天山雪蓮植株的培育，縮短育種周期，進而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪蓮在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題。
文檔編號A01H4/00GK101946699SQ20101023509
公開日2011年1月19日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者劉敏, 康喜亮, 徐琴, 波拉提, 王曉軍, 郝秀英 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所