專利名稱：一種節能減排的鮑魚育苗方法
技術領域：
本發明涉及一種水產養殖貝類育苗方法，特別涉及促進鮑苗快速生長、增強免疫 力，并能提高鮑苗成活率的方法。
背景技術：
鮑是珍貴的海產貝類之一，具有很高的營養價值。從1970年代開始，我國已開始 了人工鮑養殖，經過近三十年的發展，在遼寧、山東、福建、廣東等地區鮑養殖業已成為當地 支柱產業之一，但是隨著養殖規模的擴大、集約化程度的提高及沿海水質日趨惡化等原因， 造成鮑病日益頻繁發生，且有愈演愈烈之勢。鮑病在養殖的很多階段都有可能發生，特別是 在育苗過程中，常常會爆發大規模的掉板現象，很多養殖場連續幾月多批培苗卻顆粒無收， 給養殖戶帶來了極大的負面影響。病原體感染是引起掉板的主要原因，人工養殖條件下主要是細菌性疾病和病毒性 疾病。常見的細菌性病原體有副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等。副溶血弧菌主要導致鮑 魚肌肉萎縮病，死亡率可達50%左右，而河流弧菌和溶藻弧菌引發的感染可造成60-70% 的死亡率。目前常規的防治鮑魚掉板的方法主要是定期施用抗生素，抗生素的優點是藥物 直接入水、濃度高、吸收快、療效好；缺點是可能會對鮑魚產生刺激性、引發新病癥。如果長 期大量使用抗生素不僅會使致病菌抗藥性增強，也會使一些鮑病例變得難以治愈。此外鮑 體內抗生素殘留會影響鮑魚品質，不利于銷售，進而造成養殖者的經濟損失。中草藥防治 鮑魚掉板也是一種常見的辦法，雖具有無藥物殘留、經濟效益高的優點，但也有見效慢的缺 點，因而尋求一種更高效、經濟的辦法顯得極為迫切。蛭弧菌為寄生性革蘭氏陰性菌，具有寄生、進而裂解其它細菌的作用，是一種優良 的微生物控制劑，蛭弧菌游泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵 入宿主細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。相對于蛭弧菌蛭質體而言，用蛭弧菌游 泳體控制和消除鮑魚潛在致病菌具有起效快、活力強的優點。同時由于傳統的鮑魚育苗采 用的是流水養殖，這樣會消耗大量的人力、物力和資源，同時養殖廢水的大量排放也會給 環境帶來污染。因此，“綠色養殖”成為近年來國家的重大需求，引起水產界的廣泛關注。目前，用 蛭弧菌游泳體來進行鮑魚育苗的方式在國內外尚未報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種節能減排的鮑魚育苗方 法，在節能減排的同時，能夠提高鮑魚免疫力，提高鮑苗的成活率。本發明的目的通過下述方案實現一種節能減排的鮑魚育苗方法，其特征在于，育苗過程如下(1)培藻在育苗池中注入海水并曝氣，自然培藻，附著基為聚乙烯波紋板，光照 控制在2000-50001ux，海水水溫控制在15-28°C ；
(2)育苗培藻40天后，開始在育苗池中布鮑魚受精卵，并添加蛭弧菌游泳體菌 液，使游泳體在水體中的濃度至少達到10pfu/mL ；其中光照控制在200-30001UX，水溫控制 在 15-28 0C ；(3)換水布卵后每5-30天換水一次，每次為全池換水；換水后立即添加蛭弧菌游 泳體菌液，并使蛭弧菌游泳體在水體中的濃度至少達到10pfu/mL ；(4)采收待幼鮑殼長達到3. 0-6. 5mm,即可進行采收；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，由中國典型培養物保藏中心 保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 209172，保藏地址湖北省武漢市珞珈 山武漢大學內，保藏日期為2009年8月7日。蛭弧菌BDFM05呈單細胞，橢圓形，大小為 1. 43 X 0. 53 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度至少2 μ m ；蛭弧菌BDFM05以雙層平板法于28°C培養三 天可形成直徑2 3mm的透明圓形噬菌斑。優選地，步驟(2)中所述布卵前，育苗池徹底換水，所述蛭弧菌游泳體濃縮液在換 水后立即添加進去。優選地，步驟(2)和(3)中所述蛭弧菌游泳體在水體濃度為10_107pfu/mL。優選地，步驟(1)所述海水經過砂濾和沉淀處理。優選地，步驟(1)中所述藻為底棲硅藻。優選地，步驟(1)所述曝氣量控制在10-100L/h/m3。優選地，步驟(2)中所述布卵初始量為1 3萬粒/m3。優選地，步驟(2)中所述布卵后，根據藻生長狀態，添加營養鹽3_5g/m3，2-4天添 加一次。優選地，采用游泳體高密度發酵方法發酵制備蛭弧菌游泳體濃縮液，具體步驟 為在含有副溶血弧菌的DNB培養基中接入蛭弧菌BDFM05 (CCTCCM209172)，恒溫搖床 160rpm 250rpm、25 32°C培養12 36h ；培養物經過6000rpm、4°C離心20min，取上清 液，再將上清液16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，保留沉淀并向沉淀中加入DNB 液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌游泳體菌液。本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果1、本發明所述的蛭弧菌游泳體能消除養殖環境中的鮑魚致病菌。所述蛭弧菌游泳體對養殖環境中的常見細菌，包括副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧 菌等鮑魚致病菌有很強的消除作用。對于蛭弧菌游泳體而言，雖然存在著制備繁瑣、不易保 存的弱點，但用蛭弧菌游泳體控制和消除鮑魚致病菌具有起效快、活力強的優點。2、本發明所述的蛭弧菌游泳體能顯著提高鮑苗體質，增強免疫力。本發明中所述的蛭弧菌游泳體在控制鮑魚養殖環境、水體中細菌的效果顯著，能 夠明顯改善鮑苗體質，增強免疫力，從而提高了鮑苗培育的成活率。3、本發明所述的蛭弧菌游泳體在控制和消除鮑魚細菌應用中安全性好。蛭弧菌游 泳體通過裂解致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌游泳體可侵染、裂解宿主細菌的特性使之 適合作為抑止或清除生物體及其環境中細菌的生物凈化因子，且其在裂解完宿主細菌后， 會因饑餓而自動消亡，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和常規消毒劑對鮑魚的不利影 響。同時已有研究證明蛭弧菌對人等無毒。
4、所述的蛭弧菌游泳體能凈化水質并促進鮑魚生長。蛭弧菌游泳體對水質有凈化作用，能改善動物胃腸道環境，促進生長。5、含有本發明所述的蛭弧菌游泳體適合推廣應用于鮑魚和其他水產養殖過程。蛭弧菌游泳體對人和鮑魚無毒副作用。適合于鮑魚大規模工廠化養殖，可以為鮑 魚的綠色加工生產提供保障并且為控制和消除鮑魚致病菌提供了一種新方法。6、現有的工廠大都采用流水式養殖，如此下來，不僅耗費了巨大的人力、物力、財 力，更會對環境造成一定的污染。而采用周期換水進行布卵，可以減少了供水量的需求，節 約了生產成本，并且不會對環境造成不良影響。7、相對于蛭弧菌蛭質體而言，用蛭弧菌游泳體控制和消除鮑魚潛在致病菌具有起 效快、活力強的優點。這些優點使得蛭弧菌游泳體適合作為抑止或清除生物體及其環境中 致病菌的生物凈化因子，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和中草藥見效慢的缺點，對 防止脫板癥，提高鮑苗在波紋板上的附著量和生長速度有著極其重要的意義。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。本發明的實施地位山東某養殖場，本發明的鮑苗為皺紋盤鮑，由該養殖場提供。本 發明實施地的養殖池建在養殖大棚內，每個水池規格為2X2X0. 75m，水深為0. 45m，每池 放置曝氣管8條。培藻前各池均用高錳酸鉀溶液消毒，反復沖洗干凈。水池上方蓋上遮光 度為60%的遮光布，光照強弱可以調節，避免光照過強。光照強度一般控制在(200-5000) lux。實施例1蛭弧菌游泳體的制備使用的蛭弧菌菌株為蛭弧菌BDFM05。蛭弧菌BDFM05于2009年8月7日在武漢 大學的中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC N0:M209172。BDFM05呈單細胞， 橢圓形，大小為1. 43X0. 53iim，端生鞭毛，鞭毛長度至少2iim ；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以雙層平板法于28°C培養三天可形成直徑2 3mm的透明圓形噬菌斑，所用 的蛭弧菌游泳體通過高密度蛭弧菌游泳體的發酵方法進行發酵在裝有100mL營養肉湯 (蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)的錐形瓶中接種0. 5mL107cfu/mL副 溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，購于美國典型微生物菌種保藏中心AmericanType Culture Collection，編號:ATCC 17802)，200rpm、28 °C 搖床培養 18 小時，培養液分別于 4°C、5000rpm離心15min，棄上清。用5mL生理鹽水懸浮沉淀菌體，之后加入到一個裝有 100mL DNB (dilute nutrient broth)液體培養基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g， 酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于1000mL蒸餾水，pH值為7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入 lmL 含 103pfu/mL 的蛭弧菌 BDFM05 (CCTCC M209172)。恒溫搖床 250rpm、28°C 培養 36h。培 養液于4°C 6000rpm離心20min，取上清液，再將上清液于4°C 16000rpm離心20min，保留沉 淀，加入10mL DNB液體培培養基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg, 海水晶28g，溶于1000mL蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)重新懸浮沉淀物，得到107_109pfu/ mL的蛭弧菌游泳體。
實施例21、蛭弧菌游泳體在育苗中應用本發明一共可以分為兩個階段。第一階段是培藻，在育苗池中注入經過砂濾和沉 淀處理的海水并曝氣，附著基為聚乙烯波紋板，培藻時間為40天，這一階段不添加蛭弧菌 游泳體；第二階段是育苗，本發明的內容主要在此階段展開，育苗時間為40天，這一階段實 驗組在每次換水后立即添加蛭弧菌游泳體。將實施例1得到的蛭弧菌游泳體，以不同的換 水周期，分別向養殖水體投不同濃度的蛭弧菌游泳體。所有實驗池所處環境條件，包括溫 度、光照、PH值、鹽度等相同。所有試驗池換水周期及加菌濃度如下下面具體對本實施步驟進行描述A組正常流水，日換水量為池水量的2倍，每天早上6:00用高壓水沖洗池子，期 間不加蛭弧菌游泳體，同工廠生產方式一樣；B 組(B-l、B-2、B_3、B-4) 5 天換(全池)水一次；C 組(C-l、C-2、C-3、C-4) 10 天換(全池)水一次；D 組(D-l、D-2、D_3、D-4) 15 天換(全池)水一次；E 組(E-l、E-2、E_3、E-4) 20 天換(全池)水一次；F 組(F-l、F-2、F_3、F-4) 25 天換(全池)水一次；G 組(G-l、G-2、G_3、G-4) 30 天換(全池)水一次； B-I、C-I、D-I、E-I、F-I、G-I組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌游泳體，使 水體中蛭弧菌游泳體菌體濃度達到10pfu/mL。B-2、C-2、D-2、E-2、F-2、G-2組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌游泳體，使 水體中蛭弧菌游泳體菌體濃度達到103pfu/mL。B-3、C-3、D-3、E-3、F-3、G-3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌游泳體，使 水體中蛭弧菌游泳體菌體濃度達到105pfu/mL。B-4、C-4、D-4, E_4、F_4、G_4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌游泳體，使 水體中蛭弧菌游泳體菌體濃度達到107pfu/mL。在第一階段培藻過程中，曝氣量控制在50L/h/m3，并密切觀察，從第五天開始，可 以觀察到黃色的波紋板兩面不均勻附有褐藻，此時控制光照在2000-50001UX左右，水溫控 制在15-28°C;根據藻生長狀況適量添加營養鹽N P Si Fe = 5 1 1 1 (ppm)，， 一般的，3-5g/m3水體，2-4天添加一次，并及時將采苗框翻轉，利于藻均勻附著在波紋板上。 十天后，可以觀察到波紋板的兩面都較均勻的附著一薄層褐藻，取少量在顯微鏡下鏡檢，所 見藻類主要有大型舟形藻、小型舟形藻、菱形藻和卵形藻等，比例不一。在第二階段育苗過程中，需要合理調節光照強度，以防止藻生長過快加速老化或 生長速度過慢而被鮑苗消耗殆盡。在藻培起來后，把皺紋盤鮑的受精卵潑灑到水池里。每 池潑灑(也叫布卵)5萬個，布卵后5天附板，光照控制在200-30001UX之間，為藻提供比較 適度的光照條件，水溫控制在15-28°C。布卵三天內，可以觀察到水體中很多擔輪幼蟲，七天 后，在藻板的兩面都可以看到附著有微小匍匐幼體，小心刮取顯微鏡下鏡檢，觀察其活力。從培藻到收苗，時間為80天，稚鮑體長至3. 0-6. 5mm即可收苗，波紋板上的單細胞 藻類部分老化，少數波紋板上的藻已被吃光，所有水池沒有發現白板或脫板現象，每張波紋 板上的附苗量為300-600粒不等，最多的一張板上可以到達1200粒左右，具體育苗指標與
6測量方法如下(1)鮑苗初始量，每池5萬苗。(2)收苗平均殼長，隨機抽取50粒鮑苗，測量殼長，取平均值。(3)殼長平均日增長量，收苗平均殼長，取40天的平均值。(4)鮑苗平均個體重量，隨機抽取50粒鮑苗，稱其總重后取平均值。(5)收苗量，稱取5g鮑苗，計算其粒數，將收集的鮑苗稱其總重，后估算鮑苗的粒 數。(6)成活率，某階段結束時鮑苗量占該階段投苗量的百分率。2、鮑魚免疫指標測定試驗結束每組取樣120個，20個/管放于6個分別盛有lmLHank’ s緩沖液(pH值 7-8)的2mL-Eppendorf管中，貯于-80°C以備抗免疫指標的測定。測定時取出樣品，使其在 冰上融化，進行勻漿，然后eOOOr/min，_4°C離心5min，取上清用于免疫指標的測定。①酚氧化物酶的測定酚氧化物酶的活性測定是通過測定和L-D0PA(左旋多巴)反應生成的多巴胺的 吸光值來計算的。把每個樣品100 u L加到1. 5mL的Eppendorf管中，每個樣品重復三次。 再加入用PBS液配制的0. 5mg/mL海藻酸鈉在26-27°C下反應30min，加入50 y L的用PBS 液配制的3mg/mL的L-D0PA(左旋多巴)，lOmin后，在490nm處讀取吸光值。對照液用相應 的PBS液代替海藻酸鈉。②溶菌酶活力測定以溶壁微球菌凍干粉為底物。用0. lmol/L,pH = 6.4的磷酸鹽緩沖液配成底物懸 液(0D57Clnm 0. 3)，取3. OmL該懸液于試管內置冰浴中，再加入50 y L待測血清，混合，測A。 值。然后將試液移入37°C溫浴中置30min，取出后再置于冰浴中lOmin，以終止反應，測其A 值。溶菌活力UL按(AfA) /A式計算。表1 5天換(全池)水一次對皺紋盤鮑育苗的影響
權利要求
1.一種節能減排的鮑魚育苗方法，其特征在于，包括如下步驟(1)培藻在育苗池中注入海水并曝氣，自然培藻，附著基為聚乙烯波紋板，接藻后開 始曝氣，光照控制在2000-50001UX，水溫控制在15-28°c ；(2)育苗培藻40天后，開始在育苗池中布鮑魚受精卵，并添加蛭弧菌游泳體菌液， 使游泳體在水體中的濃度至少達到10pfu/mL ；其中光照控制在200-30001UX，水溫控制在 15-28 0C ；(3)換水布卵后每5-30天換水一次，每次為全池換水；換水后立即添加蛭弧菌游泳體 菌液，并使蛭弧菌游泳體在水體中的濃度至少達到lOpfu/mL ；(4)采收待幼鮑殼長到3.0-6. 5mm,即可進行采收；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,由中國典型培養物保藏中心保藏， 其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 209172，保藏日期為2009年8月7日。
2.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(2)中在鮑魚布卵前，育苗池徹 底換水，所述蛭弧菌游泳體菌液在換水后立即添加進去。
3.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中所述蛭弧菌游泳體 在水體中的濃度為10-107pfu/mL。
4.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(1)中所述海水經過砂濾和沉淀 處理。
5.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(1)中所述藻為底棲硅藻。
6.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(2)中所述曝氣量控制在 10-100L/h/m3。
7.根據權利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步驟(2)中所述鮑魚布卵初始量為 1 3萬粒/m3，布卵后，根據藻生長狀態，添加營養鹽3-5g/m3，2-4天添加一次。
8.根據權利要求1 7任意一項所述的育苗方法，其特征在于，所述蛭弧菌游泳體菌液 的制備方法為在含有副溶血弧菌的DNB培養基中接入蛭弧菌BDFM05，恒溫搖床160rpm 250rpm、 25 32°C培養12 36h ；培養物經過6000rpm、4°C離心20min，取上清液，再將上清液 16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，保留沉淀并向沉淀中加入DNB液體培養基重新 懸浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌游泳體菌液。
全文摘要
本發明公開了一種節能減排的鮑魚育苗方法，育苗過程如下(1)培藻；(2)育苗在育苗過程中添加蛭弧菌游泳體濃縮液，使游泳體最終在水體濃度至少達到10pfu/mL；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM 209172，保藏日期為2009年8月7日；(3)換水布卵后每5-30天一次，換水后立即添加蛭弧菌游泳體濃縮液；(4)采收。所述蛭弧菌游泳體對養殖環境中的常見細菌有很強的消除作用。由于蛭弧菌游泳體對鮑魚無毒副作用，因此適合于鮑魚大規模工廠化養殖，能提高鮑苗培育成活率。
文檔編號A23K1/18GK101999326SQ201010270979
公開日2011年4月6日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者蔣小平, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學