專利名稱：一種制備奶牛性別控制精子的方法
技術領域：
本發明涉及性別控制精子的制備方法，具體地說，涉及一種奶牛性別控制精子的 制備方法。
背景技術：
性別控制(sex control)技術，即Χ/Υ精子分離技術，是利用X、Y精子中DNA 含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根據發出的熒光強度，通過計算機預測精子類 另|J，給液滴附加電荷，根據靜電原理，將X、Y精子分離開來(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。該技術在畜牧生產中意義重 大，該技術可以按照生產需求人為地控制動物后代的性別，快速繁育高產家畜，加速家畜育 種進程，提高畜牧業的經濟效益，促進畜牧業發展。在哺乳動物中，每一個體的X精子和Y精子，其DNA含量都是恒定的。根據研究， 所有哺乳動物X染色體的DNA含量都要高于Y染色體，相差大多在3. 6% -4. 2%之間。而 這種差異就是X和Y精子流式細胞儀分離的理論基礎。其中奶牛X、Y精子差異為3. 8%， 豬為3. 6%，綿羊為4. 2%等多種哺乳動物X、Y精子DNA含量差異都已近獲得。不同動物精子對溫度的敏感性、精子膜上化學成分(如蛋白質和磷脂的比例以及 膽固醇和磷脂的比例和羥鏈的不飽和程度)等可能不同，而奶牛精子的抗凍能力比其他精 子的抗凍能力強，奶牛冷凍精子的人工授精的受胎率已達到85%以上。奶牛精清中的抗氧化物質會對原精有保護作用，但精子經過稀釋處理后，這種保 護作用就會降低。此外，在奶牛性別控制精液的生產過程中會有大量的自由氧產生，且用 流式細胞儀分離精子會導致奶牛精子的受精能力降低，尤其是再經過低溫存儲或者在液氮 中冷凍保存之后，精子的受精能力會明顯下降。同時經過分離的精子的存活時間會明顯比 原精液存活時間短。這是由于精子質膜富含不飽和脂肪酸，且對自由氧超級敏感(Sikka 1996)，因此脂質氧化在精子功能上具有關鍵的作用，而分離及冷凍操作會造成脂質過氧 化，從而造成精子的損傷尤其是對精子頂體膜的損傷。

發明內容
本發明的目的在于提供一種制備奶牛性別控制精子的方法。為了實現上述目的，本發明的制備奶牛性別控制精液的方法，其在奶牛精子分離 之前的緩沖液中加入2-0-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細胞分離儀分離奶牛精子，將分 離得到的奶牛性別控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。本發明的上述制備方法中，所述AA-2G在緩沖液中的終濃度為150-250 μ M，優 選為200 μ M ；所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述冷凍液中的濃度為150-250 μ Μ,優選為 200 μ Μ。本發明中所述性別控制精液是將精子進行性別分離制得的單一性別精液。其是通過χ/Υ精子分離技術，利用X、Y精子中DNA含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根 據發出的熒光強度，通過計算機預測精子類別，然后給液滴附加電荷，根據靜電原理，將Χ、Υ 精子分離開來，從而對精子進行性別分離，制得單一性別精液。 2-0-葡萄糖苷抗壞血酸(AA-2G)是抗壞血酸(VC)的一種衍生物，由于2位上有 葡萄糖基掩蔽，所以不易發生氧化，所以在水溶液中特別穩定，并且沒有直接還原性。AA-2G 在酶的作用下能很快的釋放出高活性的VC，能很快與自由基反應以降低脂質過氧化作用。 因此，在奶牛精子上分離機之前的緩沖液中和分離后的收集液中添加抗氧化劑AA-2G，能夠 提高奶牛性控 精子的受精能力和存活時間，且該性控冷凍精液進行人工輸精后受胎率達到 85%以上。 具體地說，本發明的制備奶牛性別控制精液的方法，包括如下步驟1)取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200 X IO6精子/mL，然后加入熒 光染料煙酸己可堿(H33342)至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量體積比4%提純卵黃和重量體積比5%食品紅的!fepes緩沖液進一 步稀釋至100 X IO6精子/mL;其中，添加食品紅的目的是減弱死精子上的H33342熒光，使這部分精子在分離過 程中被棄除，提高分離精子的活力；3)然后用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離，回收分離得到的奶牛性別控 制精子，并收集在含有150-250 μ M AA-2G的冷凍液中；當精子收集到8 X IO6精子時，立刻 在4°C溫度、840g下離心20min，棄掉上清；4)用含有AA-2G的冷凍液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml
細管裝管、密封。特別地，密封后的奶牛性別控制精子可以在15°C保存，也可以投入到液氮中冷凍， 制得冷凍精子。本發明中的冷凍液可以選用現有技術中常用的冷凍液，例如李喜和主編的《家畜 性別控制技術》(北京科學出版社，2009)中公開的冷凍I液、冷凍II液等，其中冷凍I液 可以按如下配比進行配制首先配置Tris-A工作液50ml Tris-AU. 766g Trisma Base、 0. 8615g檸檬酸、0. 6325g D-果糖，攪拌30min，再加入超純水50ml，調節pH為6. 8,0. 22 μ m 過濾除菌，5°C保存可供14天使用；其次配置25ml 20%卵黃Tris-A液19. 9ml Tris-A工 作液、5. Iml卵黃液，攪拌15min，5°C溫度下12h析出沉淀，靜止后析出表面卵脂，并在3850g 的條件下離心5min，取上清再過濾滅菌，5°C保存可供7天使用。本發明中所提到的重量體積比的單位均為g/ml。通過本發明方法制得的奶牛性別控制精子可以進行人工輸精、或直接冷凍保存。本發明的優點在于，本發明通過在奶牛精子分離之前的緩沖液中和分離后的收集 冷凍液中添加抗氧化劑AA-2G，制得奶牛性別控制精子。由于AA-2G在水溶液中很穩定，因 此奶牛性別控制精子在分離過程中的損傷能在很大程度得到避免，能夠提高精子品質、提 高精子的受精能力，還能夠延長存活時間；本發明的制備方法操作簡單，能夠廣泛應用于商 業化推廣中，具有廣闊的市場前景。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。以下實 施例中的重量體積比的單位均為g/ml。實施例11、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為150 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有250 μ M AA-2G的冷凍I液中；當精子收集到8\106精子時，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細管裝管，密封后在15°C保存。實施例21、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為250 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有150 μ M AA-2G的冷凍I液中；當精子收集到8\106精子時，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細管裝管，密封后在15°C保存。實施例31、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為200 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細胞分離儀進行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有200 μ M AA-2G的冷凍I液中；當精子收集到8\106精子時，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細管裝管，密封后在15°C保存。實施例4緩沖液中加入AA-2G的作用根據實施例1的制備方法同時進行了 4組試驗，其中對照組在分離前的緩沖液中 不添加任何抗氧化劑、A組添加AA-2G ；M組添加褪黑素；E組添加維生素E。各組抗氧化劑 的用量如表1所示，并用等量hepes緩沖液溶解，其余步驟及條件均與實施例1相同。將制 得的牛性別控制精液在37°C條件下，熒光顯微鏡檢測精子活力，結果如表1所示。表1不同抗氧化劑對奶牛精子活力及存活時間的影響
權利要求
1.一種制備奶牛性別控制精子的方法，其特征在于，在奶牛精子分離之前的緩沖液中 加入2-0-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細胞分離儀分離奶牛精子，將分離得到的奶牛性 別控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在緩沖 液中的終濃度為150-250 μ M。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在緩沖 液中的終濃度為200 μ Μ。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述 冷凍液中的濃度為150-250 μ Μ。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述 冷凍液中的濃度為200 μ Μ。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)取一定量奶牛原精液，用Hepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入熒光染料 煙酸己可堿至終濃度為0. IlmM及2-0-葡糖糖苷抗壞血酸至終濃度為150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量體積比4%提純卵黃和重量體積比5%食品紅的!fepes緩沖液進一步稀 釋至100 X IO6精子/mL;3)然后用流式細胞分離儀進行奶牛精子分離，回收分離得到的奶牛性別控制精子，并 收集在含有150-250μΜ 2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中；當精子收集到8 X IO6精子 時，立刻在4°C溫度、840g下離心20min，棄掉上清；4)用含有AA-2G的冷凍液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3X IO6精子0. 25ml細管 裝管，密封。
全文摘要
本發明提供了一種制備奶牛性別控制精子的方法，其是在奶牛精子分離之前的緩沖液中加入2-O-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細胞分離儀分離奶牛精子，將分離得到的奶牛性別控制精子回收到含有2-O-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。本發明的優點在于，本發明通過在奶牛精子分離之前的緩沖液中和分離后的精子收集液中添加抗氧化劑AA-2G來制備奶牛性別控制精子，能夠避免奶牛性別控制精子在性別分離處理過程中的損傷，提高精子品質及精子的受精能力，還能夠延長存活時間；本發明的制備方法操作簡單，能夠廣泛應用于商業化推廣中，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A01N1/02GK102144631SQ201110059938
公開日2011年8月10日 申請日期2011年3月11日 優先權日2011年3月11日
發明者吳中紅, 夏春梅, 安磊, 楊升, 田見暉 申請人:中國農業大學