專利名稱：荻的組織培養基及組培方法
技術領域：
本發明涉及以荻種子為外植體，進行組織培養的培養基及組培方法。
背景技術：
荻(Miscanthus saccharif lorus (Maxim.) Benth)是禾本科芒屬草本水陸兩生植物。在自然環境下，荻具粗壯被鱗片的根莖，稈直立，無毛，具多節，節上具須毛，高100 400cm。分布全國各地，多生長于山谷、山坡及灘地上。荻喜光、耐寒、耐澇，抗逆性強，地上部分的生物量大。在環境保護、景觀營造、生物質能源、制漿造紙、防沙固提中有巨大的潛力， 還可代替木材和塑料作制造人造板的原料等。因此，荻是開發價值很高的重要能源植物和材料植物。芒屬植物的組織培養從二十世紀90年代開始陸續有報道，但多集中在芒和五節芒愈傷組織及植株再生等方面的研究。經檢索，至今未發現通過荻組織培養，建立不定芽快繁體系，并繁殖生根，培育成完整植株的相關報道。

發明內容
組培快繁技術已在很多植物上作為經濟、高效的繁殖方法應用，周期短、繁殖系數高、成本低，并不受時間和空間的制約。現有繁殖技術中，荻作為商業項目開發時人工繁育的成本高，而且其有效種子量少，難以大面積人工種植。為滿足荻人工快速繁育、大面積豐產栽培的需要，本發明要解決的技術問題是以荻的種子為外植體，建立一種荻的不定芽誘導、增殖和誘導生根的培養基及組培快繁方法。本發明的技術問題通過如下技術方案解決荻的組織培養基，包括不同誘導時期的四種培養基，各種培養基的原料及其附加量分別是(1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L， 培養基的PH值為5.7;(2)不定芽誘導培養基以MS為基本培養基，附加6-BA0. 5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養基以MS為基本培養基，附加6-BA0. 3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(4)誘導生根培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L，瓊脂6. 5 8. Og/L、NAA 0. 2 1. Omg/L,培養基的 pH 值為 5. 7 ；用上述培養基進行荻的組織培養方法，按如下步驟進行(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗2h、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO 真空滅菌20min、無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養將經步驟(1)無菌條件下獲得的種子接入初代培養基中，其中前7天置于暗柜中培養，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養，培養溫度為25 士 2°C，獲得幼苗；(3)不定芽誘導將初代培養后發育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導培養基中，經過15d誘導培養，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗他，光照強度為40 50 μ mo 1 πι 培養溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養基中，經過28天增殖培養，增殖系數為10 20，觀天繼代1次，共繼代3次；光照培養，光暗周期為光16h/暗 8h，光照強度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養溫度為25士2°C，培養出不定芽；(5)生根誘導選取健壯不定芽接入生根培養基中，進行生根誘導，培養21天，生根率達99% ；光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養溫度為25 士 1 °C，培養出幼苗，組培的全過程結束。本發明的有益效果是應用荻種子為外植體，用萌發后的幼苗進行不定芽誘導并進行生根培養，有效地提高荻的繁殖系數，為荻商業化生產提供充足的種苗源。與播種繁殖相比，組織培養法能有效利用種子，提高萌發率，縮短育苗周期，無菌條件下種子只需2周即可萌發，在一個為期6 個月的生長周期內組織培養法的繁殖系數為播種繁殖的100 150倍。
具體實施例方式本發明下面結合實施例作進一步詳述本荻不定芽誘導和不定芽增殖的培養基中，選用MS作基本培養基，這是經過用MS、1/2MS、B5、N6四種基本培養基各自均附加蔗糖 20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L、6_BA即6-氨基腺嘌呤0 2. Omg/L, KT即激動素0 2. Omg/L、NAA即α -萘乙酸0 0. lmg/L, pH值5. 7，進行試驗，每組重復3次，每種基本培養基有20個外植體的對比試驗得出的。因用MS作基本培養基中處理28天后，不定芽發育最好，誘導的不定芽數最多，質量最好，決定選用MS作基本培養基。總之，本發明所公開的培養基其配比值、溫度、凝固劑等也可用諸如白砂糖、水晶洋菜等替代，培養基各原料的配比值也可分別采用本發明最佳方案定值的接近值取代。下面給出的是本發明的實施例。荻的組織培養基，包括不同誘導時期的四種培養基。現將四種培養基的原料及其附加量分別按七項實施例列于表1-4 初代培養基(表1):
基本培養基附加原料 (g/L)實施 例1234567MS蔗糖20-3020253020302525瓊脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.58.5不定芽誘導培養基(表2)基本培養基附加原料 (g/L 或 mg/L)實施 例1234567MS6-BA0.5-20.51.220.51.21.22NAA0.05-0.10.050.070.10.070.10.050.07瓊脂 6.5-8.56.57.58.56.57.57.58.5蔗糖20-3020253025302025不定芽增殖培養基(表3)
基本培附加原料實施例養基(g/L 或 mg/L)12345676-BA 0.3-1.50.30.91.50.30.90.91.5MSNAA 0.1-0.20.10.150.20.150.20.10.15蔗糖20-3020253020202530瓊脂 6.5-8.56.57.58.57.57.56.57.5誘導生根培養基(表4)
基本培養基附加原料 (g/L 或 mg/L)實施 例1234S67蔗糖20-3020253020252530瓊脂6.5-86.57.287.286.57.2NAA0.2-10.20.610.20.60.61實施例1 (對照表1-4中相應實施例的原料及附加量)(1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養基的pH 值為5. 7 ；(2)不定芽誘導培養基以MS為基本培養基附加6-BAO. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養基MS基本培養基附加6-BA 0. 3mg/L, NAA 0. lmg/L、蔗糖 20g/L、瓊脂6. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(4)誘導生根培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20g/L，瓊脂6. 5g/L、NAA 0. 2mg/L,培養基的pH值為5. 7 ；用上述的培養基進行荻的組織培養方法按如下步驟進行(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗2h、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO 真空滅菌20min、無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養將經步驟(1)無菌條件下獲得的荻種子接入初代培養基中，其中前7天置于暗柜中培養，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養，培養溫度為 25士2°C，獲得幼苗；(3)不定芽誘導將初代培養后發育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導培養基中，經過15d誘導培養，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗他，光照強度為40 50 μ mo 1 πι 培養溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養基中，經過28天增殖培養，增殖系數為10 20，28天繼代1次，共繼代3次，光照培養，光暗周期為光16h/暗 8h，光照強度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養溫度為25士2°C，培養出不定芽；(5)生根誘導選取健壯不定芽接入生根培養基中，進行生根誘導，培養21天，生根率達99%，光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養溫度為25士 1°C，培養出幼苗，組培的全部過程結束。上述培養基中MS基本培養基及其它相關化學品可市售獲得，按商品說明書配用， 為同行所公知。其余實施2-7，均對照表1-4中對應實施例原料及附加量，與實施例1相同方法獲得組織培養基和組培幼苗。七項實施例中，以實施例1-3優選。
權利要求
1.一種荻的組織培養基，其特征是包括不同誘導時期的四種培養基，各種培養基的原料及其附加量分別是(1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L、瓊脂6.5 8. 5g/L，培養基的PH值為5.7 ；(2)不定芽誘導培養基以MS為基本培養基，附加6-BA0.5 2. Omg/L、NAA 0. 05 0. lmg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(3)不定芽增殖培養基以MS為基本培養基，附加6-BA0.3 1. 5mg/L、NAA 0. 1 0. 2mg/L、蔗糖20 30g/L、瓊脂6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ；(4)誘導生根培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L，瓊脂6.5 8. Og/L、 NAA 0. 2 1. Omg/L,培養基的pH值為5. 7 ；
2.一種用權利要求1所述的培養基進行荻的組織培養方法，其特征是經過以下步驟(1)外植體采集與消毒選取健壯的荻種子，依次進行洗滌劑清洗Imin、自來水沖洗池、超凈工作臺上用75%乙醇滅菌30s、無菌水沖洗3 4次、濃度為0. 525%的NaClO真空滅菌20min，無菌水沖洗5 6次后和用滅菌濾紙吸干種子表面水分；(2)初代培養將經步驟(1)無菌條件下獲得的荻種子接入初代培養基中，其中前7天置于暗柜中培養，后7天置于光暗周期為光16h/暗他的條件下培養，培養溫度為25士2°C， 獲得幼苗；(3)不定芽誘導將初代培養后發育健壯的幼苗切去胚根根，接入不定芽誘導培養基中，經過15d誘導培養，獲得不定芽，每日光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50 μ mo 1 m、—1，培養溫度為 25士2°C ；(4)不定芽增殖培養將獲得的不定芽接入不定芽增殖培養基中，經過觀天增殖培養， 增殖系數為10 20，28天繼代1次，共繼代3次；光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50μπιΟ1 HT2s-1,培養溫度為25士2°C，培養出不定芽；(5)生根誘導選取健壯不定芽接入生根培養基中，進行生根誘導，培養21天，生根率達99%;光照培養，光暗周期為光16h/暗他，光照強度為40 50 μ mol πΓ、—1，培養溫度為 25士 1°C，培養出幼苗，組培的全過程結束。
全文摘要
一種荻的不定芽誘導、增殖和生根培養基，包括不同培養時期的四種培養基(1)初代培養基，(2)不定芽誘導培養基，(3)不定芽增殖培養基，(4)誘導生根培養基，這四種培養基均以MS為基本培養基，附加蔗糖、瓊脂等物質，pH5.7。用上述四種培養基進行荻不定芽誘導、增殖及生根的組培方法經過如下五個步驟一是外植體的采集與消毒，二是初代培養，三是不定芽誘導，四是不定芽增殖培養，五是生根誘導。經過上述五步驟的培育為快速而優質地培養出荻幼苗打好堅實的基礎。應用本培養基組培，再生植株能保持母本優良性狀，提高幼苗繁殖速度，擴大繁殖數量，并能有效利用種子、縮短育苗周期，滿足社會需求。
文檔編號A01H4/00GK102239808SQ20111020738
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者張啟香, 洪春桃, 胡恒康, 鄭炳松, 郭海鵬 申請人:浙江農林大學