專利名稱：水迷宮空間學習記憶樹鼩模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及生命科學領域中一種新型實驗動物行為學模型的建立方法，特別是一種水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法。
背景技術：
Morris水迷宮實驗是目前世界公認的較為客觀的空間學習記憶功能評價方法，由 Richard Morris在1981年設計并應用于學習記憶腦機制研究，是一種動物能夠學會在水箱內游泳并找到藏在水下逃避平臺的實驗方法，由于沒有任何可接近的線索以標識平臺的位置，所以動物的有效定位能力需應用水箱外的結構，例如貼于水迷宮箱體上的一些簡單圖形標志，作為空間定位的線索。近年來水迷宮實驗廣泛應用于神經生物學、神經心理學，神經藥理學，老年病學等研究領域，基于強迫動物在池中游泳，通過尋找在水中設置的平臺，來測試動物對空間位置覺和方位覺的學習記憶能力。迷宮由圓形水池、自動攝像及分析系統兩部分組成，圖像自動采集和處理系統主要由攝像機、計算機、圖像監視器組成，動物入水后啟動監測裝置，記錄動物運動軌跡，試驗完畢自動分析報告相關參數。空間學習記憶是腦的高級神經生理活動之一，是檢測空間定向，反應時間，視知覺和結構應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關于場景和事件的學習記憶，牽涉多個腦區、多種神經遞質和細胞內信號分子，是一項十分復雜的神經生理活動過程。在以往的經典的海馬損傷實驗中，在定向航行中海馬損傷組的潛伏期明顯長于皮質損傷組和對照組的結果，確認了海馬與空間識別學習的聯系，海馬突觸的可塑性和長時程增強效應是空間學習和記憶的神經功能基礎。因此，實驗動物腦結構功能系統特別包括海馬結構功能與人的一致性程度決定了水迷宮實驗在醫學生物學中的作用，而在所有文獻報道及使用的Morris水迷宮實驗中，現成功應用的均為大鼠及小鼠Morris水迷宮空間學習記憶模型，由于大鼠和小鼠均屬于低等嚙齒類，腦結構功能與人相差甚遠，水迷宮空間學習記憶模型得到的數據參考性有限，因此大大限制了此模型在各個領域的作用。樹駒(Tupaia belangeri，tree shrews)是一種新型的實驗動物，在分類學上屬哺乳綱，有胎盤類，是一個獨立的目，稱為攀駒目(kandentia)，介于靈長目與食蟲目之間。由于其具有體型小，易飼養和操作，管理方便，廉價經濟，且其進化程度高，遠比大小鼠接近于人類，新陳代謝和大體解剖與人較為接近等優點，因此其作為較理想的實驗動物，已經被廣泛地應用于醫學與生物學的研究中。在以往的研究中發現，樹駒腦神經組織在其形態、細胞構筑、分布、各大腦皮質區的比例、丘腦一些核團的體積和靈長目高度分化的腦神經組織有許多相似之處；且樹駒腦結構分化程度較高，與靈長目一致，從其種系發生較晚的前額區型皮質所占比例，是腦高級功能研究的理想對象。體重與腦的關系，可用Jerisian公式中的K值來表示，K值隨物種的不同而異，在一定程度上代表著腦重隨體重的變化速率，其大小除能反映動物腦的演變水平外，尚能反映動物的智力水平，在假設的個體大小相等的動物中，分類地位越高，K值越大，腦的重量也隨之增加。在最近的研究中，從樹駒，恒河猴以及大鼠三種動物的K值看， 樹駒是大鼠的2. 25倍，結果說明樹駒的分類地位高于大鼠，腦智力水平也更高。而在對海馬的研究上發現，樹駒與恒河猴的海馬發育模式較之大鼠更為類似，在發育過程中，海馬的絕對增重倍數比例較低；且樹駒和恒河猴兩種動物的海馬相對重量在亞成體中低于新生個體，變化趨勢是同樣逐漸降低，而大鼠的海馬相對重量在亞成體中高于新生個體，變化趨勢是逐漸升高。從三種動物的海馬變化情況推測隨著腦組織從新生到亞成體的發育，智力水平高的恒河猴和樹駒其海馬的重要性相對減弱；而對于低智力水平的大鼠其重要性相對增強，在海馬的系統發育及系統的腦結構功能上，樹駒較大鼠更為接近人類。綜上所述，選用無論是腦結構功能、還是針對水迷宮空間學習記憶模型中最重要的海馬結構功能的發育，都遠比低等的嚙齒動物大小鼠更為接近人類的實驗動物樹駒，建立的水迷宮空間學習記憶樹駒模型，更適合于腦結構功能的研究，水迷宮空間學習記憶樹鼠句模型的建立將可以很大程度上替代和擴展原有的模型在人類的衛生醫藥事業服務的應用范圍，很大程度上解決現有的水迷宮空間記憶模型缺陷與科研生產對模型開發需求的矛盾，在學習記憶、海馬研究、智力與衰老、新藥開發、篩選、評價等多個學科和領域取得更大的進展。水迷宮空間學習記憶模型一般分為以定位航行實驗作為評判空間學習能力的空間學習模型和以空間探索實驗作為評判空間記憶能力的空間記憶模型兩個部分。經典的水迷宮空間學習記憶的大小鼠模型中，將定位航行實驗中的正確率正確率，即正確上站臺的次數/總訓練次數在90%以上，平均潛伏期逐漸縮短至25秒以內，并在之后持續的實驗中進入一個穩定的平臺期，平均總距離隨訓練次數增加逐漸降低直至穩定，平均速度隨訓練次數增加逐漸升高直至穩定，搜索策略由邊緣式或隨機式逐漸轉為趨向式和直線式，作為空間學習模型成立的成模指標；而將空間探索實驗中在靶象限活動時間的比率和穿臺次數在訓練前后有顯著性差異作為空間記憶模型成立的成模指標。

發明內容
鑒于現在對水迷宮空間學習記憶新興實驗動物模型開發的需求，并針對現有的科研用樹駒人工飼養馴化時間短，膽小，易受驚，難以建立水迷宮空間學習記憶模型等特點， 本發明設計了一種水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，該方法包括實驗前對動物的篩選，實驗裝置準備，實驗操作以及成模指標四個步驟，一、實驗前對動物的篩選實驗前樹駒一直飼養于安靜及光照節律如常的環境中，在實驗前對樹駒施以用手抓放的預處理。將候選的子一代樹駒輕柔的放入水迷宮水池中，選擇IOs之內開始游動，游泳速度> 15cm/s的樹駒，總篩選游動時間為30s。在IOs之內仍漂浮于水面上靜止不動，或游泳速度過慢的樹駒不具備游泳能力的樹駒不適合于水迷宮空間學習記憶模型的建立。二、實驗裝置準備水迷宮的水池內水溫保持在23士0. 5°C，水溫需嚴格控制，水溫過高，則樹駒很可能會選擇游泳或漂浮而不是上臺。在水迷宮水池中加入奶粉增強樹駒和周圍環境的對比度，在一噸水中約加入300g奶粉，水迷宮實驗視頻分析系統參數選擇為黑鼠白色背景，二值化處理的閾值設定為75，在同樣燈光條件下，此閾值在整個水迷宮實驗中是一個穩定值。
所用的水迷宮水池直徑為160cm，站臺直徑為9cm。實驗裝置應放置在安靜寬敞的房間內，設備周圍用圍簾以阻隔實驗者和受試樹鼠句。三、實驗操作1、定位航行實驗在每1個訓練日，每1只樹駒施以2組訓練，每組實驗包括實驗前將樹駒控制置于站臺上適應15s，隨后將樹駒采用半隨機方式從不同象限面壁置入池內，樹駒登上站臺 &后終止記錄，最長記錄時間為75s，若樹駒在75s內不能上臺，引導其登上站臺適應15s。 如此將樹駒置入游泳池，2次為1組。在前3天的訓練中，在1組訓練結束后，額外增加一次上臺訓練，即在離站臺較近距離處置入樹駒，輔助其上臺，教導其在臺上停留15s，此步驟的目的是使樹駒學會實驗的規則，即在隱藏平臺上等待“救援”及理解如何得到救援。每個訓練日中將樹駒置入同一個水池象限中，錄像記錄每次上臺潛伏期、游泳距離等數據，計算得到如下數據(1)正確率，所有樹駒每天成功登上站臺的次數/總訓練次數；(2)平均潛伏期，所有樹駒每天的潛伏期總和/總訓練次數；(3)平均總距離，所有樹駒每天登上站臺前的游泳總距離/總訓練次數；⑷平均速度，所有樹駒每天登上站臺前的速度總和/總訓練次數；( 訓練前后的搜索策略變化趨勢；主要以此5個數據來評判樹駒的空間學習記憶能力。2、空間探索實驗7天后定位航行成立，撤除水面下的站臺，然后將樹駒隨機從不同象限面壁置入池內1次，記錄樹駒在75s內的游泳軌跡并進行分析，最后將樹駒擦干放入樹駒籠。測量樹鼠句在靶象限活動時間的比率和穿臺次數，以評判樹駒的空間記憶能力。定位航行實驗和空間探索實驗應選擇在樹駒進食期剛過，處于活動高峰期，比較適合模型的建立。每組訓練過后，將樹駒放回籠具中，并喂食面包蟲給予獎勵。若樹駒在75s內不能上臺，引導其登上站臺適應15s。四、成模指標根據以往有關文獻規定，并考慮樹駒水迷宮實驗的數據，確定水迷宮空間學習樹鼠句模型的建立方法成模指標為在定位航行實驗中，正確率(正確次數/總訓練次數)在 90%以上；平均潛伏期介于20-2 之間作為判定實驗動物樹駒在水迷宮實驗中建立了空間學習記憶性學習模型的標準；在空間探索實驗中，以在靶象限活動時間的比率和穿臺次數在訓練前后有顯著性差異作為判定樹駒在水迷宮實驗中建立了空間記憶性模型的標準; 模型在第7個訓練日結束時即達到標準。平均總距離和平均速度以及搜索策略的變化趨勢作為參考指標，平均總距離隨訓練次數增加逐漸降低直至穩定，平均速度隨訓練次數增加逐漸升高直至穩定，搜索策略由本能的邊緣式或盲目的隨機式逐漸轉為較高級的趨向式和準確的直線式，邊緣式是一種沿池壁以大幅度軌跡搜索平臺的方式，是一種本能行為，處于較低級的認知水平；隨機式的搜索軌跡往往出現在迷宮大部分區域，帶有很大的盲目性。而趨向式是以曲線逐步向平臺靠攏，是一種較高級的策略，但定位不夠準確，直線式為從起點以直線方式向平臺搜索，表明有明確的空間定位。本發明公開了以上所述的關于樹駒水迷宮空間學習記憶模型的建立中所有特征的具體步驟，所述方法包括實驗前對樹駒的篩選，實驗設備準備中針對樹駒的水溫、水池各參數優化設置，實驗操作步驟中針對樹駒的訓練，在訓練步驟、次數、時間、頻率以及獎勵政策上均經過多次實驗反復論證得到，最后由于樹駒與大小鼠在游泳能力、腦結構功能及動物特征上的不同，水迷宮空間學習記憶樹駒模型比大小鼠模型具有與人更為類似的優勢， 且在第7天成模，比之大小鼠第10天成模也更具有時間上的優勢。通過此水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，使得水迷宮空間記憶樹駒模型成功建立。實驗結果表明，本發明最終能夠使得正確率，即正確上站臺的次數/總訓練次數在95%以上，平均潛伏期逐漸縮短至25秒以內，并在之后持續的實驗中進入一個穩定的平臺期，平均總距離隨訓練次數增加逐漸降低直至穩定，平均速度隨訓練次數增加逐漸升高直至穩定，搜索策略由邊緣式或隨機式逐漸轉為趨向式和直線式，表明水迷宮空間學習樹鼠句模型已成功建立。同時通過這學習過程，導致在空間探索實驗中，樹駒在靶象限活動時間延長，約為30% -60%停留于靶象限，穿越平臺位置的次數大大增加，在訓練前后有顯著性差異，樹駒幾乎均停留于靶象限附近活動，說明樹駒在訓練之后空間記憶形成，水迷宮空間記憶樹駒模型模型成立。


圖1為正確率隨訓練次數增加的變化趨勢圖，可以看出正確率隨訓練次數增加而增加，至第7天達到95 %，證明空間學習模型成立。圖2為平均潛伏期隨訓練次數增加的變化趨勢圖，可以看出平均潛伏期隨訓練次數增加而減少，至第7天達到25秒以內，證明空間學習模型成立。圖3為平均總距離隨訓練次數增加的變化趨勢圖，可以看出平均總距離隨訓練次數增加而減少。圖4為平均速度隨訓練次數增加的變化趨勢圖，可以看出平均速度隨訓練次數增加而減少，直至穩定。圖5為訓練前后的搜索策略變化趨勢圖，圓形水池中的小圓圈表示站臺的位置。 可以看出搜索策略由本能且盲目的邊緣式或隨機式逐漸轉為有高級策略的趨向式和有明確空間定位的直線式，證明空間學習模型成立。圖6為空間探索實驗中樹駒的典型游泳軌跡圖，圓形水池中的小圓圈表示站臺的位置。可以看出在空間探索實驗中，樹駒在靶象限活動時間比率幾乎達到60%，說明樹駒在訓練之后空間記憶形成，空間記憶模型成立。
具體實施例方式一、實驗前對動物的篩選實驗用樹駒為實驗室自繁的子一代中緬樹駒，12月齡，體重在110g_120g，實驗前樹駒一直飼養于安靜及光照節律如常的環境中，在實驗前對樹駒施以用手抓放的預處理。 從13只雄性樹駒中選擇得到10只IOs之內開始游動，游泳速度> 15cm/s的樹駒，總篩選游動時間為30s的子一代樹駒；從15只雌性樹駒中選擇得到10只放入水迷宮實驗水池中 IOs之內開始游動，游泳速度> 15cm/s的樹駒，總篩選游動時間為30s的子一代樹鼠句。二、實驗裝置準備水迷宮實驗按照要求為一直徑160cm、高50cm的圓形水池，購自上海移數信息科技有限公司。水池內壁被漆為黑色，池內水深30cm，水溫保持在23士0.5°C。房間內光照恒定，無光線直射在水池內。池壁上以四個等距離點將水池分為四個象限，在靶象限，也即設為第一象限內的距離池壁25cm處放有一個直徑為9側、高^cm的圓形透明站臺，站臺上設置有條紋，以供樹駒攀爬，防止打滑，站臺位于水面下lcm。池壁內貼有不同形狀及顏色的標記物。迷宮上方安置連接顯示系統的攝像機，同步記錄樹駒運動軌跡。采用上海移數軟件科技有限公司研制開發的Morris水迷宮實驗視頻分析系統進行信息處理。在水迷宮水池中加入奶粉增強樹駒和周圍環境的對比度，在一噸水中約加入300g奶粉，水迷宮實驗視頻分析系統參數選擇為黑鼠白色背景，二值化處理的閾值設定為75，在同樣燈光條件下，此閾值在整個水迷宮實驗中是一個穩定值。三、實驗操作1、定位航行實驗在每1個訓練日，每1只樹駒施以2組訓練，每組實驗包括實驗前將樹駒控制置于站臺上適應15s，隨后將樹駒采用半隨機方式從不同象限面壁置入池內，樹駒登上站臺 &后終止記錄，最長記錄時間為75s，若樹駒在75s內不能上臺，引導其登上站臺適應15s。 如此將樹駒置入游泳池，2次為1組，在前3天的訓練中，在1組訓練結束后，額外增加一次上臺訓練，即在離站臺較近距離處置入樹駒，輔助其上臺，教導其在臺上停留15s，使樹駒學會實驗的規則，在隱藏平臺上等待“救援”及理解如何得到救援。每個訓練日中將樹駒置入同一個水池象限中，錄像記錄上臺潛伏期、游泳距離等數據，計算得到正確率、平均潛伏期、 平均總距離、平均速度并記錄訓練前后的搜索策略變化趨勢5個指標評判樹駒的空間學習記憶能力，以證明水迷宮空間學習樹駒模型的建立。2、空間探索實驗定位航行7天后撤除水面下的站臺，然后將樹駒隨機從不同象限面壁置入池內1 次，記錄樹駒在75s內的游泳軌跡并進行分析，最后將樹駒擦干放入樹駒籠。測量靶象限的游泳時間以及穿越平臺位置的次數，評判樹駒的空間記憶能力，以證明水迷宮空間記憶樹鼠句模型的建立。定位航行實驗和空間探索均在樹駒進食過的時間進行，每組訓練過后，將樹駒放回籠具中，并喂食Ig面包蟲/只樹駒。實驗裝置放置于安靜寬敞的房間內，設備周圍用圍簾以阻隔實驗者和受試樹鼠句。四、成模指標通過此水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，使得水迷宮空間記憶樹駒模型成功建立。實驗結果如圖1、2、3和4表明，20只樹駒用于建立水迷宮空間學習記憶模型實驗，在第7個訓練日結束時達到水迷宮空間學習模型的成模指標正確率為95%，平均潛伏期逐漸縮短至24. 96秒，并在之后持續的實驗中進入一個穩定的平臺期，平均總距離隨訓練次數增加逐漸降低直至穩定，平均速度隨訓練次數增加逐漸升高直至穩定，搜索策略由邊緣式或隨機式逐漸轉為趨向式和直線式，結果如圖5所示，表明水迷宮空間學習樹駒模型已成功建立。同時通過這學習過程，導致在空間探索實驗中，樹駒在靶象限活動時間延長，約為 30% -60%停留于靶象限，穿越平臺位置的次數大大增加，在訓練前后有顯著性差異，樹鼠句幾乎均停留于靶象限附近活動，說明樹駒在訓練之后空間記憶形成，水迷宮空間記憶樹鼠句模型模型成立。樹駒在訓練前后穿臺次數有了顯著性的差異，訓練前20只樹駒的總穿臺次數僅為3次，訓練后為36次，如表1所示；且樹駒在靶象限活動時間延長，約為30% -60%停留于靶象限，典型游泳軌跡如圖6所示，樹駒幾乎均停留于靶象限附近活動，說明樹駒在訓練之后空間記憶形成，證明空間記憶模型成立。表1空間探索實驗中穿臺次數的比較
權利要求
1.一種水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于該方法包括實驗前對動物的篩選，實驗裝置準備，實驗操作以及成模指標四個步驟，一)、實驗前對動物的篩選將候選的子一代樹駒輕柔的放入水迷宮水池中，選擇IOs之內開始游動，游泳速度彡15cm/s的樹駒，總游動時間為30s ；二)、實驗裝置準備水迷宮水池的水溫保持在23士0. 5°C，在水迷宮水池中加入奶粉增強樹駒和周圍環境的對比度，一噸水中約加入300g奶粉，水迷宮實驗視頻分析系統參數選擇為黑鼠白色背景，二值化處理的閾值設定為75，在同樣的燈光條件下，此閾值在整個水迷宮實驗中是一個穩定值；三)、實驗操作 (1)、定位航行實驗在每個訓練日，每只樹駒施以2組訓練，每組實驗包括實驗前將樹駒控制置于站臺上適應15s，隨后將樹駒采用半隨機方式從不同象限面壁置入水池內開始記時，樹駒登上站臺 5s后終止記錄，最長記錄時間為75s，2次為1組；每個訓練日中將樹駒置入同一個水池象限中，根據錄像記錄每次上臺前的游動軌跡，計算得到下面數據正確率平所有樹駒每天成功登上站臺的次數/總訓練次數； 平均潛伏期所有樹駒每天的潛伏期總和/總訓練次數； 平均總距離所有樹駒每天登上站臺前的游泳總距離/總訓練次數； 平均速度所有樹駒每天登上站臺前的速度總和/總訓練次數； 繪制得到訓練前后的搜索策略變化趨勢； 主要以上述數據來評判樹駒的空間學習記憶能力； O)、空間探索實驗7天后定位航行成立，撤除水面下的站臺，然后將樹駒半隨機從不同象限面壁置入池內 1次，記錄樹駒在75s內的游泳軌跡并進行分析，最后將樹駒擦干放入樹駒籠；測量并計算樹駒在靶象限活動時間的比率和穿臺次數，以評判樹駒的空間記憶能力；定位航行實驗和空間探索實驗應選擇樹駒進食期剛過，每組訓練過后，將樹駒放回籠具中，并喂食面包蟲給予獎勵；四)、成模指標確定水迷宮空間學習樹駒模型的建立方法成模指標為在定位航行實驗中，正確率在 90%以上；平均潛伏期介于20-2 之間作為判定樹駒在水迷宮實驗中建立了空間學習性學習模型的標準；在空間探索實驗中，以在靶象限活動時間的比率和穿臺次數在訓練前后有顯著性差異作為判定樹駒在水迷宮實驗中建立了空間記憶性模型的標準；模型在第7個訓練日結束時即達到標準。
2.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于步驟一)中在IOs之內仍漂浮于水面上靜止不動，或游泳速度過慢的樹駒不適合于水迷宮空間學習記憶模型的建立。
3.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于步驟二)中實驗裝置應放置在安靜寬敞的房間內，周圍用圍簾以阻隔實驗者和受試樹鼠句。
4.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于模型建立中所用的水迷宮水池直徑為160cm，站臺直徑為9cm。
5.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于步驟三)中若樹駒在75s內不能上臺，引導其登上站臺適應15s。
6.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于步驟三)中，在前3天的訓練中1組訓練結束后，額外增加一次上臺訓練，即在離站臺較近距離處置入樹駒，輔助其上臺，教導其在臺上停留15s，此步驟的目的是使樹駒學會實驗的規則， 即在隱藏平臺上等待“救援”及理解如何得到救援。
7.如權利要求1所述的水迷宮空間學習記憶樹駒模型的建立方法，其特征在于步驟三)中，平均總距離和平均速度以及搜索策略的變化趨勢作為參考指標，平均總距離隨訓練次數增加逐漸降低直至穩定，平均速度隨訓練次數增加逐漸升高直至穩定，搜索策略由本能的邊緣式或肓目的隨機式逐漸轉為較高級的趨向式和準確的直線式。
全文摘要
一種水迷宮空間學習記憶樹鼩模型的建立方法，包括實驗前對動物的篩選，實驗裝置準備，實驗操作以及成模指標四個步驟，確定水迷宮空間學習樹鼩模型的建立方法成模指標為在定位航行實驗中，正確率在90%以上；平均潛伏期介于20-25s之間作為判定樹鼩在水迷宮實驗中建立了空間學習性學習模型的標準；在空間探索實驗中，以在靶象限活動時間的比率和穿臺次數在訓練前后有顯著性差異作為判定樹鼩在水迷宮實驗中建立了空間記憶性模型的標準。
文檔編號A01K15/02GK102499105SQ20111029345
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月6日 優先權日2011年10月6日
發明者仝品芬, 孫曉梅, 江勤芳, 王文廣, 罕園園, 陸彩霞 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所