專利名稱：培育食用菌高硒耐受性菌種的方法
技術領域：
本發明涉及高硒材料的制備方法，具體是指一種培育食用菌高硒耐受性菌種的方法。
背景技術：
硒是人和動物體內必需的微量元素，是構成谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、硒蛋白P等多達23種功能蛋白的活性中心，具有以下功效(1)清除體內過氧化物、自由基，保護細胞結構與功能不受干擾與損害，延緩衰老；(2)加速致癌物質的代謝，促進DNA損傷修復，降低癌癥發病率；(3)拮抗體內有毒物質，降低其毒性，有效保護肝臟；(4)增強機體細胞免疫功能，提高機體免疫力。而硒的嚴重缺乏會直接導致克山病和大骨節病，其中克山病最早發現與70年代的黑龍江克山縣，是以心臟呈不同程度的擴張，嚴重時呈球形，心肌有散在不同程度的壞死灶及斑痕區為主要表現的心肌病；大骨節病是以骨關節增粗、畸形為主要表現的一種地方病。土壤缺硒是全世界廣泛存在的問題，盡管我國的湖北恩施有世界硒都之稱，陜西紫陽也是一個富硒區，但是我國存在一個從東北黑龍江省一直延伸到西南云南省的低硒帶，占據我國國土面積的72%。在這些低硒區，農作物等食物的生長過程中無法從土壤中獲取充足的硒，從而形成食物鏈的普遍缺硒狀態，因此這些區域的人體內也處于缺硒的狀態， 研究顯示中國人均日攝入硒的總量約為35yg，顯著低于世界衛生組織(WHO)推薦的硒日攝入量50-200 μ g。因此，補充硒的有效攝入成為我國低硒地區的迫在眉睫的問題。食用菌因其具有繁殖時間短、生物量大、蛋白含量高等特點，同時具有傳統的保健功能，而且對硒具有一定的富集作用，對其進行富硒研究和開發具有廣闊的應用前景。但是，目前的專利主要集中在對食用菌的富硒營養強化、作為直接食用的農產品進行開發， 如富硒秀珍菇菌粉的制備方法(中國專利申請200610135227. 2)、富硒雙孢菇的工廠化栽培方法(中國專利申請200910067431. 9)，尚未開展任何將食用菌作為高硒載體、作為食品、保健品的添加劑的形式進行開發。目前有兩項專利在菌種的富硒馴化上開展了一些工作，如富硒香菇菌種馴化與栽培方法(中國專利申請200810010300. 2)、富硒桑黃菌菌種馴化、栽培、富集方法(中國專利申請200710011014. 3)，但是其只經過簡單的兩級馴化，其目的也不是獲取最大耐硒濃度的菌種，而且利用以上兩種專利中的簡單兩級馴化方法并不能獲得高硒耐受性菌種。本發明因此而來。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育食用菌高硒耐受性菌種的方法，進而獲取高硒食用菌材料，為開發更豐富、更有效的補硒產品提供優質的材料。本發明的技術方案如下一種培育食用菌高硒耐受性菌種的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)根據食用菌菌種選擇適應食用菌菌種生長的培養基，將食用菌菌種接入培養基中進行試管菌種培養得到初始菌懸液；
(2)將培養基與硒源混合配制成梯度硒濃度的耐硒培養基，采用菌懸液接種方式將食用菌菌種接種到滅菌處理后的耐硒培養基上按照硒濃度從低到高的順序按照常用的食用菌菌種培養方式逐一硒濃度進行耐硒培養；首次耐硒培養使用的菌懸液為初始菌懸液，耐硒培養得到的菌懸液為下一硒濃度進行耐硒培養使用的菌懸液，依次類推；當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上；ii)菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；且相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值在預定閾值內時，停止耐硒培養，并確定食用菌的最佳耐受硒濃度為前一批次耐硒培養基的硒濃度；(3)根據步驟( 得到的食用菌的最佳耐受硒濃度采用菌懸液接種方式，進行連續轉接培養，并確定菌種的耐硒性狀穩定，即得到食用菌高硒耐受性菌種。優選的，所述方法中當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上；ii)菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度，使耐硒培養基的硒濃度大于前一批次耐硒培養基的硒濃度，且耐硒培養基的硒濃度小于當前批次耐硒培養基的硒濃度，然后以調整硒濃度后的耐硒培養基按照步驟O)的方法繼續進行耐硒培養。優選的，所述方法中調整耐硒培養基的硒濃度是根據預定閾值或預定閾值的整數倍數進行調整，當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上；ii)菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度為當前批次耐硒培養基的硒濃度減去預定閾值或預定閾值的整數倍數后的硒濃度。優選的，所述方法中調整耐硒培養基的硒濃度是根據相鄰批次耐硒培養基的硒濃度進行調整，當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上；ii)菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度為相鄰批次耐硒培養基的硒濃度的平均值。優選的，所述方法中適應食用菌菌種生長的培養基為PDA綜合培養基。
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優選的，所述方法中PDA綜合培養基每IOOml定容培養基中，所用原料為馬鈴薯 20g，葡萄糖 2g，瓊脂 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4O. 3g，VBl 0. OOlg，pH 調至 6. 0。優選的，所述方法中所述PDA綜合培養基的配制方法包括先將應加入的馬鈴薯與蒸餾水混勻，保持沸騰30分鐘后過濾，加入其他原料并充分混合后定容至所需體積的步
馬聚ο優選的，所述方法中硒源選自亞硒酸鈉、硒酸鈉或富硒酵母粉。優選的，所述方法步驟(3)中進行連續轉接培養時，出現以下情形a)菌種無法生長；b)菌種生長周期差異明顯；c)菌種生物量差別明顯；d)菌株明顯變色；則判斷不滿足耐硒性狀穩定的條件；否則認為耐硒性狀穩定。優選的，所述方法還包括在步驟C3)獲得食用菌高硒耐受性菌種后將所獲得的高硒耐受性菌種接入到含最佳耐硒濃度的含硒PDA綜合培養基的固體斜面上培養，并于_80°C甘油管中作為高硒耐受性菌種保存的步驟。所述的預定閾值為根據食用菌耐硒培養的需要和其他因素確定的硒濃度變異的值，可以是恒定的值，也可以是變動的值，如遞歸減小的值。具體的，本發明培育食用菌高硒耐受性菌種的方法，按照以下步驟進行(1)將食用菌菌種接入經滅菌處理后的PDA綜合培養基中進行試管菌種培養；(2)將硒源與PDA綜合培養基按照一定的配比進行混合，制作成由低(一級)到高 (N級)的系列濃度梯度的含硒培養基，然后滅菌；(3)采用菌懸液接種方式，將步驟1培養的試管菌種接入步驟2制備的一級含硒培養基中，進行食用菌菌種一級耐硒培養；(4)采用菌懸液接種方式，將步驟3培養的一級耐硒菌種接入步驟2制備的二級含硒培養基中，進行食用菌菌種二級耐硒培養；(5)依此類推，直至食用菌菌種生長出現下列情形之一 (1)菌株生長周期延長至對照組的一倍以上；( 菌種生物量下降至對照組的30%以下，甚至不生長；C3)菌株明顯變色；則停止耐硒培養；(6)將出現步驟5中抑制現象的培養基硒濃度和出現步驟5中抑制現象的前一硒濃度的中值硒濃度作為進一步的優化培養濃度；(7)重復步驟5和6，直至找到食用菌菌種的最佳耐硒濃度；(8)在最佳耐硒濃度下采用菌懸液接種方式，連續轉接3次，保證菌種的耐硒性狀穩定；(9)將所獲得的高硒耐受性菌種接入到含最佳耐硒濃度的含硒PDA綜合培養基的固體斜面上培養，并于-80°C甘油管中作為高硒耐受性菌種保存。所述高硒耐受性菌種是指該菌種經過逐級耐硒培養，直到出現下列情形之一所獲得的菌種(1)菌株生長周期延長至對照組的一倍以上；( 菌種生物量下降至對照組的 30%以下，甚至不生長；C3)菌株明顯變色。所述對照組通常采用前一硒濃度的耐硒培養基。
所述PDA綜合培養基配方為每IOOml定容培養基中，所用原料為馬鈴薯20g，葡萄糖 2g，瓊脂 1. 5g, MgS04 · 7H20 0. 15g, KH2P04 0. 3g, VBl 0. OOlg, pH 調至 6. 0 ；所述 PDA 綜合培養基配置方法是先將應加入的馬鈴薯與蒸餾水混勻，保持沸騰30分鐘后過濾，力口入其他原料并充分混合后定容至所需體積。所述硒源是指亞硒酸鈉、硒酸鈉或富硒酵母粉。所述耐硒性狀穩定是指在轉接3 次的過程中，未出現以下情形(1)菌種無法生長；( 菌種生長周期差異明顯；C3)菌種生物量差別明顯；(4)菌株明顯變色。本發明判斷不進行耐硒培養的標準是通過食用菌菌種生長是否出現明顯抑制現象來進行的。食用菌菌種生長出現明顯抑制現象是指出現下列情形之一 (1)菌株生長周期延長至對照組的一倍以上；( 菌種生物量下降至對照組的30%以下，甚至不生長；(3) 菌株明顯變色。另外還需要判斷高硒耐受性食用菌菌種的穩定性情況，申請人確定耐硒性狀穩定按照以下標準在轉接3次的過程中，未出現以下情形(1)菌種無法生長；( 菌種生長周期差異明顯；C3)菌種生物量差別明顯；(4)菌株明顯變色。相比于現有技術，本發明具有以下有益效果1、大幅提高食用菌的高硒耐受性經過食用菌菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，對培養基中的硒含量的耐受性大幅提高，一般是對照狀態的3-5倍；2、大幅提高食用菌中的硒含量經過食用菌菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，其富集硒的能力大幅提高，體內的總硒含量可達對照組的10倍以上， 其中以硒代蛋氨酸為主；3、大幅縮短食用菌液體深層培養的生長周期經過食用菌菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，生長周期縮短至對照組的2/3-1/2 ；4、可生產高硒材料通過食用菌菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，可獲得高硒材料，一般菌種的高硒含量可達1000毫克/千克(干重)以上，而靈芝的高硒含量可達10000毫克/千克(干重)以上。這些高硒材料可作為食品、保健品的優質硒源添加劑。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不能用來限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件作進一步調整，未說明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1獲取靈芝高硒耐受性菌種的步驟(1)高硒耐受性靈芝菌種的制備1)從中國科學院菌種保藏中心購買靈芝菌種(編號5. 653)。2)將靈芝菌種接入經滅菌處理后的PDA綜合培養基中進行試管菌種培養。3)將亞硒酸鈉(NajeO3)與PDA綜合培養基按照一定的配比進行混合，制作 NajeO3含量為2、20、50、100、200、400、600、800、1000mg/L的系列濃度梯度的含硒培養基， 然后滅菌備用。4)采用菌懸液接種方式，將步驟2培養的試管菌種接入步驟3制備的ang/L的含硒培養基中，進行靈芝菌種一級耐硒培養。5) 一級耐硒培養完成后，采用菌懸液接種方式，將步驟4培養的一級耐硒菌種接入步驟3制備的20mg/L的含硒培養基中，進行靈芝菌種二級耐硒培養。6)依此類推，直至靈芝菌種在200mg/L的含硒培養基中，出現生長緩慢、生物量顯著降低、變色等明顯抑制現象，停止耐硒培養。7)以抑制濃度200mg/L和前一濃度100mg/L的中值硒濃度150mg/L作為進一步的優化培養濃度。8)將在200mg/L的含硒培養基中生長的靈芝菌種采用菌懸液接種方式接入經滅菌處理后的150mg/L的含硒培養基中，進行一級優化培養。9) 一級優化培養完成后，將步驟8培養的一級優化靈芝菌種接入175mg/L (步驟8 中的硒濃度與抑制濃度的中值硒濃度)的含硒培養基中，進行二級優化培養。10)在步驟9中，靈芝菌種出現如步驟6中的抑制現象，停止培養。11)以步驟9中的硒濃度與步驟7中的硒濃度的中值濃度160mg/L作為進一步的優化培養濃度。12)將步驟9中生長的靈芝菌種接入到步驟11中的滅菌含硒培養基中，生長正常， 可作為該靈芝菌種的最佳耐硒濃度。13)在160mg/L含硒培養基下采用菌懸液接種方式，將步驟12中生長的菌種連續轉接3次，保證菌種的耐硒性狀穩定。14)將步驟13中所獲得的高硒耐受性靈芝菌種接入到160mg/L含硒培養基的固體斜面上培養，并于-80°C甘油管中作為高硒耐受性靈芝菌種保存。(2)高硒耐受性靈芝菌種的應用將上述獲得的高硒耐受性靈芝菌種與未經過高硒耐受性培養的同一靈芝菌種逐級接入到滅菌處理后的 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500mg/L亞硒酸鈉的液體發酵培養基中進行液體深層發酵富硒培養，監測其生長規律，并檢測成熟靈芝菌絲體中的硒含量。(3)實施效果靈芝高硒耐受性提高經過靈芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，對培養基中的硒含量的耐受性可達1200mg/L，是對照狀態的3倍。靈芝硒含量提高經過靈芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，其富集硒的能力大幅提高，體內的總硒含量在最高耐硒度(1200mg/L)條件下可達對照組中最高總硒含量的10倍以上，其中硒存在的形態以硒代蛋氨酸為主。大幅縮短靈芝液體深層培養的生長周期經過靈芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，生長周期縮短至對照組的1/2。可生產高硒材料通過靈芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，可獲得靈芝高硒材料，最高硒含量可達18000毫克/千克(干重)以上，且以安全有效的有機硒存在，可作為食品、保健品的優質硒源添加劑。實施例2 獲取云芝高硒耐受性菌種的步驟(1)高硒耐受性云芝菌種的制備1)從中國科學院菌種保藏中心購買云芝菌種(編號5. 48)。
2)將云芝菌種接入經滅菌處理后的PDA綜合培養基中進行試管菌種培養。3)將硒酸鈉(NajeO4)與PDA綜合培養基按照一定的配比進行混合，制作NajeO4 含量為2、20、50、100、200、400、600、800、1000mg/L的系列濃度梯度的含硒培養基，然后滅
菌備用。4)采用菌懸液接種方式，將步驟2培養的試管菌種接入步驟3制備的ang/L的含硒培養基中，進行云芝菌種一級耐硒培養。5) 一級耐硒培養完成后，采用菌懸液接種方式，將步驟4培養的一級耐硒菌種接入步驟3制備的20mg/L的含硒培養基中，進行云芝菌種二級耐硒培養。6)依此類推，直至云芝菌種在200mg/L的含硒培養基中，出現生長緩慢、生物量顯著降低、變色等明顯抑制現象，停止耐硒培養。7)以抑制濃度200mg/L和前一濃度100mg/L的中值硒濃度150mg/L作為進一步的優化培養濃度。8)將在200mg/L的含硒培養基中生長的云芝菌種采用菌懸液接種方式接入經滅菌處理后的150mg/L的含硒培養基中，進行一級優化培養。9) 一級優化培養完成后，將步驟8培養的一級優化云芝菌種接入175mg/L (步驟8 中的硒濃度與抑制濃度的中值硒濃度)的含硒培養基中，進行二級優化培養。10)在步驟9中，云芝菌種出現如步驟6中的抑制現象，停止培養。11)以步驟9中的硒濃度與步驟7中的硒濃度的中值濃度160mg/L作為進一步的優化培養濃度。12)將步驟9中生長的靈芝菌種接入到步驟11中的滅菌含硒培養基中，云芝菌種出現如步驟6中的抑制現象，停止培養。13)以步驟11中的硒濃度與步驟7中的硒濃度的中值濃度130mg/L作為進一步的優化培養濃度。14)將步驟12中生長的云芝菌種接入到步驟13中的滅菌含硒培養基中，生長正常，可作為該云芝菌種的最佳耐硒濃度。15)在130mg/L含硒培養基下采用菌懸液接種方式，將步驟14中生長的菌種連續轉接3次，保證菌種的耐硒性狀穩定。16)將步驟15中所獲得的高硒耐受性云芝菌種接入到130mg/L含硒培養基的固體斜面上培養，并于-80°C甘油管中作為高硒耐受性云芝菌種保存。(2)高硒耐受性云芝菌種的應用將上述獲得的高硒耐受性云芝菌種與未經過高硒耐受性培養的同一云芝菌種逐級接入到滅菌處理后的 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500mg/L硒酸鈉的液體發酵培養基中進行液體深層發酵富硒培養，監測其生長規律，并檢測成熟云芝菌絲體中的硒含量。(3)實施效果云芝高硒耐受性提高經過云芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，對培養基中的硒含量的耐受性可達1000mg/L，是對照狀態的3-4倍。云芝硒含量提高經過云芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，其富集硒的能力大幅提高，體內的總硒含量在最高耐硒度(1000mg/L)條件下可達對照組中最高總硒含量的8-12倍以上，其中硒存在的形態以硒代蛋氨酸為主。大幅縮短云芝液體深層培養的生長周期經過云芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，生長周期縮短至對照組的2/3。可生產高硒材料通過云芝菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，可獲得云芝高硒材料，最高硒含量可達7000-9000毫克/千克(干重)以上，且以安全有效的有機硒存在，可作為食品、保健品的優質硒源添加劑。實施例3 獲取杏鮑菇高硒耐受性菌種的步驟(1)高硒耐受性杏鮑菇菌種的制備1)從中國科學院菌種保藏中心購買杏鮑菇菌種(編號5. 775)。2)將杏鮑菇菌種接入經滅菌處理后的PDA綜合培養基中進行試管菌種培養。3)將亞硒酸鈉(NajeO3)與PDA綜合培養基按照一定的配比進行混合，制作 NajeO3含量為2、20、50、100、150、200、300、40011^/1的系列濃度梯度的含硒培養基，然后滅
菌備用。4)采用菌懸液接種方式，將步驟2培養的試管菌種接入步驟3制備的ang/L的含硒培養基中，進行杏鮑菇菌種一級耐硒培養。5) 一級耐硒培養完成后，采用菌懸液接種方式，將步驟4培養的一級耐硒菌種接入步驟3制備的20mg/L的含硒培養基中，進行杏鮑菇菌種二級耐硒培養。6)依此類推，直至杏鮑菇菌種在150mg/L的含硒培養基中，出現生長緩慢、生物量顯著降低、變色等明顯抑制現象，停止耐硒培養。7)以抑制濃度150mg/L和前一濃度100mg/L的中值硒濃度120mg/L作為進一步的優化培養濃度。8)將在100mg/L的含硒培養基中生長的杏鮑菇菌種采用菌懸液接種方式接入經滅菌處理后的120mg/L的含硒培養基中，進行優化培養，生長正常，可作為該杏鮑菇菌種的最佳耐硒濃度。9)在120mg/L含硒培養基下采用菌懸液接種方式，將步驟9中生長的菌種連續轉接3次，保證菌種的耐硒性狀穩定。10)將步驟9中所獲得的高硒耐受性杏鮑菇菌種接入到90mg/L含硒培養基的固體斜面上培養，并于-80°C甘油管中作為高硒耐受性杏鮑菇菌種保存。(2)高硒耐受性杏鮑菇菌種的應用將上述獲得的高硒耐受性杏鮑菇菌種與未經過高硒耐受性培養的同一杏鮑菇菌種逐級接入到滅菌處理后的 100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L 硒酸鈉的液體發酵培養基中進行液體深層發酵富硒培養，監測其生長規律，并檢測成熟杏鮑菇菌絲體中的硒含量。(3)實施效果杏鮑菇高硒耐受性提高經過杏鮑菇菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，對培養基中的硒含量的耐受性可達800mg/L，是對照狀態的4-5倍。杏鮑菇硒含量提高經過杏鮑菇菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，其富集硒的能力大幅提高，體內的總硒含量在最高耐硒度(800mg/L)條件下可達對照組中最高總硒含量的10倍以上，其中硒存在的形態以硒代蛋氨酸為主。
大幅縮短杏鮑菇液體深層培養的生長周期經過杏鮑菇菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，生長周期縮短至對照組的1/2。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種培育食用菌高硒耐受性菌種的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)根據食用菌菌種選擇適應食用菌菌種生長的培養基，將食用菌菌種接入培養基中進行試管菌種培養得到初始菌懸液；(2)將培養基與硒源混合配制成梯度硒濃度的耐硒培養基，采用菌懸液接種方式將食用菌菌種接種到滅菌處理后的耐硒培養基上按照硒濃度從低到高的順序按照常用的食用菌菌種培養方式逐一硒濃度進行耐硒培養；首次耐硒培養使用的菌懸液為初始菌懸液，耐硒培養得到的菌懸液為下一硒濃度進行耐硒培養使用的菌懸液，依次類推；當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上； )菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；且相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值在預定閾值內時，停止耐硒培養，并確定食用菌的最佳耐受硒濃度為前一批次耐硒培養基的硒濃度；(3)根據步驟(2)得到的食用菌的最佳耐受硒濃度采用菌懸液接種方式，進行連續轉接培養，并確定菌種的耐硒性狀穩定，即得到食用菌高硒耐受性菌種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上； )菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度，使耐硒培養基的硒濃度大于前一批次耐硒培養基的硒濃度，且耐硒培養基的硒濃度小于當前批次耐硒培養基的硒濃度，然后以調整硒濃度后的耐硒培養基按照步驟(2)的方法繼續進行耐硒培養。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中調整耐硒培養基的硒濃度是根據預定閾值或預定閾值的整數倍數進行調整，當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上； )菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度為當前批次耐硒培養基的硒濃度減去預定閾值或預定閾值的整數倍數后的硒濃度。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中調整耐硒培養基的硒濃度是根據相鄰批次耐硒培養基的硒濃度進行調整，當食用菌菌種生長出現下列情形之一時i)菌株生長周期延長至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的一倍以上； )菌種生物量下降至前一硒濃度的耐硒培養基培養時的30%以下，甚至不生長；iii)菌株明顯變色；當相鄰批次耐硒培養基的硒濃度差值大于預定閾值時，調整耐硒培養基的硒濃度為相鄰批次耐硒培養基的硒濃度的平均值。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中適應食用菌菌種生長的培養基為PDA綜合培養基。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中PDA綜合培養基每IOOml定容培養基中，所用原料為馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4 0. 3g, VBl 0. OOlg, pH 調至 6. 0。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中所述PDA綜合培養基的配制方法包括先將應加入的馬鈴薯與蒸餾水混勻，保持沸騰30分鐘后過濾，加入其他原料并充分混合后定容至所需體積的步驟。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中硒源選自亞硒酸鈉、硒酸鈉或富硒酵母粉。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)中進行連續轉接培養時，出現以下情形a)菌種無法生長；b)菌種生長周期差異明顯；c)菌種生物量差別明顯；d)菌株明顯變色；則判斷不滿足耐硒性狀穩定的條件；否則認為耐硒性狀穩定。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括在步驟(3)獲得食用菌高硒耐受性菌種后將所獲得的高硒耐受性菌種接入到含最佳耐硒濃度的含硒PDA綜合培養基的固體斜面上培養，并于-80 ！甘油管中作為高硒耐受性菌種保存的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種培育食用菌高硒耐受性菌種的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)根據食用菌菌種選擇適應食用菌菌種生長的培養基，將食用菌菌種接入培養基中進行試管菌種培養得到初始菌懸液；(2)將培養基與硒源混合配制成梯度硒濃度的耐硒培養基，采用菌懸液接種方式將食用菌菌種接種到滅菌處理后的耐硒培養基上按照硒濃度從低到高的順序按照常用的食用菌菌種培養方式逐一硒濃度進行耐硒培養；(3)根據步驟(2)得到的食用菌的最佳耐受硒濃度采用菌懸液接種方式，進行連續轉接培養，并確定菌種的耐硒性狀穩定，即得到食用菌高硒耐受性菌種。經過食用菌菌種的高硒耐受性培養后，其在液體深層培養的狀態下，對培養基中的硒含量的耐受性大幅提高。
文檔編號C05G1/00GK102511305SQ201110402189
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者胡海濤, 袁林喜 申請人:蘇州硒谷科技有限公司