專利名稱：應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法。
背景技術：
沉香是我國、日本、印度以及東南亞國家的傳統名貴藥材和世界知名名貴香料。所謂沉香，為瑞香科沉香屬的部分種和擬沉香屬的部分種以自然、微生物或人工方式使之發生生物化學過程形成的產品，能生產沉香的植物統稱為沉香樹。沉香屬有18種，主要分布于印度、中國、東南亞以及馬來半島。我國有土沉香和云南沉香兩個種。現有人工結香方法有五種。第一、砍傷法樹干用刀造成3 4cm傷口，幾年后在傷口處形成沉香。第二、打釘法鐵釘打入樹干任其生銹，爾后產香。第三、鑿洞法樹干用鑿孔機開孔洞，爾后產香。第四、化學刺激法在樹干上開一小孔，在小孔中滴入乙烯利、甲酸、冰醋酸等化學物質，刺激沉香的形成。第五、接菌法樹干用鑿孔機開孔洞接種真菌，真菌寄生在沉香樹上促使木材薄膜細胞貯存物質產生生理變化，最后在組織中形成香脂。前三種方法被稱為傳統方法，這三種方法費時費工、時間長、產量低且質量不穩定，但其要求的技術門檻低，仍有不少香農延用此技術；化學刺激法所產生沉香由于安全問題不宜入藥。 國內外近年來的研究認為，接菌法促進沉香形成具有安全有效、時間短的優點，形成沉香大約只需要2年的時間。但由于接菌的成功與否受環境條件影響較大，且形成沉香的范圍僅局限在接菌四周，為提高產量，需要在樹干打很多菌孔。綜上所述，現有人工結香方法仍存在缺陷，不利于工業產業上廣泛應用推廣。

發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供一種應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，利用該方法生產沉香時間短、產量高，有利于工業化生產。本申請的發明人經研究發現，人工接菌后真菌的代謝產物是誘導沉香樹形成沉香的關鍵因素，同時，本申請的發明人還發現，再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)為沉香樹結香部位的十余種真菌之一，其代謝產物能大大促進沉香樹結香。因此，本發明的技術方案是直接滴注再育鐮刀菌的發酵液誘導沉香樹形成沉香。這種技術手段既簡便又能避免接菌過程受環境影響的缺陷。同時，發酵液在植物的蒸騰作用的帶動下，能快速地遍布樹體，既促進沉香的快速形成又提高沉香的產量。本發明的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法包括以下步驟1)再育鐮刀真菌的培養將由沉香樹結香部位分離得到的鐮刀真菌自低溫保藏的斜面試管轉接于盛有PDA 培養基的培養皿中，于26 下培養3 5天后，待菌絲長滿培養基后再轉接于盛有PDA 液體培養基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養1周；2)發酵液的獲取
從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，濾液即為發酵液；3)滴注發酵液將發酵液分裝于輸液器具中，在沉香樹干上鉆孔，將輸液器具中的發酵液注射經鉆孔滴注式輸入樹體。優選地，由沉香樹結香部位分離再育鐮刀真菌的步驟包括a)取樣在沉香樹結香部位取樣；b)樣品消毒在0. 的升汞溶液中浸泡lmin，無菌水清洗后，75%乙醇中浸泡 Imin，無菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺上用無菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養基中J6 恒溫培養，待長出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉接至新的平板， 繼續沈 恒溫培養；d)將步驟c)獲得的菌種進行鑒定，選取其中的再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)轉接試管斜面進行低溫保藏。再育鐮刀菌在PDA培養基上培養3天， 菌落呈圓形，菌絲體白色毛絮狀，后期中央菌絲體由白色轉為紫色。大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，無色透明，具2 5個隔膜；小型分生孢子呈卵形、梨形或腎形，無色透明。優選地，滴注發酵液的沉香樹干為樹齡5年以上的土沉香、奇楠沉香或馬來沉香。優選地，在春夏季天氣晴朗的時候滴注發酵液。優選地，鉆孔在沉香樹干的同一高度的東西兩側進行。優選地，自首次滴注發酵液2個月后再滴注一次發酵液。優選地，所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個分支輸液管，主液管上設流速控制器，分支輸液管末端連接針頭。優選地，鉆孔的孔徑與針頭的孔徑匹配。與現有技術相比，本發明產生的顯著效果是1.結香周期短沉香形成的時間縮短為1年；2.沉香產量高形成沉香的范圍大，由樹干至分枝及根部均可形成沉香，沉香總產量較現有人工結香方法提高4 5倍；3.生產工藝簡單；4.運用生物技術，所產沉香為無公害產品，宜作藥用。
具體實施例方式下面通過具體實施例子對本發明作進一步詳細說明。實施例1應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法1)由沉香樹結香部位分離再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)a)取樣在沉香樹結香部位取樣；b)樣品消毒在0. 的升汞溶液中浸泡lmin，無菌水清洗后，75%乙醇中浸泡 Imin，無菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺上用無菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養基中J6 恒溫培養，待長出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉接至新的平板，繼續沈 恒溫培養；d)將步驟C)獲得的菌種轉接試管斜面進行低溫保藏。2)再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)的培養將由沉香樹結香部位分離得到的再育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)自低溫保藏的斜面試管轉接于盛有PDA培養基的培養皿中，于沈 下培養3 5天后，待菌絲長滿培養基后再轉接于盛有PDA液體培養基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養1周。3)發酵液的獲取從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，濾液即為發酵液。4)滴注發酵液在天氣晴朗的時候，將發酵液分裝于輸液器具中，在樹齡為5年以上的沉香樹干的同一高度的東西兩側分別鉆孔，將輸液器具中的發酵液經鉆孔以滴注方式輸入樹干中， 所述沉香樹干為土沉香、奇楠沉香或馬來沉香。所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個分支輸液管，主液管上設流速控制器，分支輸液管末端連接針頭，發酵液裝在輸液袋中，通過主液管上的流速控制器控制發酵液從輸液袋流出的速度，從而控制發酵液由針頭輸入鉆孔中的流速。為防止浪費，鉆孔時控制孔徑的大小與針頭的孔徑大小相等。5)自首次滴注發酵液2個月后再一次滴注發酵液。實施例2應用本發明的方法誘導沉香樹產生沉香的產量的測試選取6年生土沉香樹5株，分別命名為A1-A5，5株土沉香樹的平均胸徑12. 46cm, 在離地面30cm處，直徑為11 15cm的樹干段上使用電鉆(鉆頭Φ = 0. 2cm)鉆一小孔， 孔深約3cm。取再育鐮刀菌發酵液1000ml裝于輸液器具中，在天氣晴朗的條件下，往預先鉆好的小孔中對樹體滴注式真菌發酵液，約2 3天后輸液完成。2個月后再輸液一次。1年后取下(上至離滴注口 70cm下至離滴注口 30cm的)Im樹干段，去除非棕褐色部分，經曬干后即為沉香，測定其重量并參照2010版《中華人民共和國藥典》測定其醇浸出物含量，結果如表1。表 權利要求
1.應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其包括以下步驟1)再育鐮刀菌的培養將由沉香樹結香部位分離得到的再育鐮刀菌自低溫保藏的斜面試管轉接于盛有PDA 培養基的培養皿中，于26 下培養3 5天后，待菌絲長滿培養基后再轉接于盛有PDA 液體培養基的三角瓶中，再置于搖床上震蕩培養1周；2)發酵液的獲取從搖床上取下三角瓶，用紗布濾去菌絲體，得到發酵液；3)滴注發酵液將發酵液分裝于輸液器具中，在沉香樹干上鉆孔，將輸液器具中的發酵液注射進鉆孔中。
2.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于由沉香樹結香部位分離再育鐮刀菌的方法包括以下步驟a)取樣在沉香樹結香部位取樣；b)樣品消毒在0.1%的升汞溶液中浸泡lmin，無菌水清洗后，75%乙醇中浸泡lmin，無菌水清洗；c)菌種的分離純化在超凈工作臺上用無菌剪刀挑取樣品中心部分，置于PDA培養基中，沈 恒溫培養，待長出菌絲后，挑取平板中單一菌落的菌絲轉接至新的平板，繼續 26 恒溫培養；d)將步驟c)獲得的再育鐮刀菌轉接試管斜面進行低溫保藏。
3.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于滴注發酵液的沉香樹干為樹齡5年以上的土沉香、奇楠沉香或馬來沉香。
4.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于在春夏季天氣晴朗的時候滴注發酵液。
5.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于鉆孔在沉香樹干的同一高度的東西兩側進行。
6.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于自首次滴注發酵液2個月后再滴注一次發酵液。
7.如權利要求1所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于所述輸液器具包括輸液袋、輸液軟管和針頭；輸液軟管固定在輸液袋下方，呈倒“Y”字形，上方為主液管，下方為兩個分支輸液管，主液管上設流速控制器，分支輸液管末端連接針頭。
8.如權利要求7所述的應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其特征在于鉆孔的孔徑與針頭的孔徑匹配。
全文摘要
本發明涉及一種應用真菌發酵液誘導沉香樹快速形成沉香的方法，其將由沉香樹結香部位分離純化得到的再育鐮刀菌(Fusariumproliferatum)進行培養、發酵，然后取發酵液滴注到沉香樹上的鉆孔內，發酵液在沉香樹內誘導形成沉香。本發明的方法簡單，沉香形成的時間縮短為1年；沉香產量較現有人工結香方法提高4～5倍，1米長直徑為10cm的樹干能產生合格沉香200～300克。
文檔編號A01G1/04GK102550311SQ20111045331
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者周再知, 林明平, 梁坤南, 馬華明, 黃桂華 申請人:中國林業科學研究院熱帶林業研究所