專利名稱：一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌及其制劑和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌及其制劑和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是我國農(nóng)業(yè)部2008年11 號公告批準(zhǔn)使用的飼料級菌株之一。地衣芽孢桿菌屬于能夠產(chǎn)生芽孢的兼性厭氧微生物。菌體繁殖速度快、抗逆性強，并且能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸。與乳酸菌和雙歧桿菌等相比，芽孢桿菌的優(yōu)點在于它對外界不良環(huán)境有很強的抵抗力，與同為芽孢桿菌的枯草芽孢桿菌相比，地衣芽孢桿菌生長溫度高5 7V ；其次，其生長速率適中，容易使剛跨膜的未合適折疊的蛋白充分折疊；此外，地衣芽孢桿菌分泌蛋白至培養(yǎng)基中的能力大約是枯草芽孢桿菌的2倍，異源蛋白表達水平已報道達到20 25mg/mL，為所見報道的所有芽孢桿菌中表達水平最高者。地衣芽孢桿菌治療下痢和腹瀉效果很好，是制造微生態(tài)制劑的理想菌株。在我國，沈陽第一制藥于1992年上市銷售的“整腸生”，其主要成分就為地衣芽孢桿菌，抗腹瀉效果顯著，而且無副作用。目前芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝主要有兩種固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法。固體發(fā)酵法產(chǎn)量低，勞動強度大，易污染，但投資較少。目前國內(nèi)許多小規(guī)模的芽孢桿菌生產(chǎn)廠家多采用這種生長方式，生產(chǎn)水平參差不齊，產(chǎn)品活菌數(shù)從每克幾十億到幾百億不等。液體發(fā)酵工藝具有產(chǎn)量大、機械化程度高、易于監(jiān)控、深層發(fā)酵轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點，但是設(shè)備投資高，動力消耗較大。這種生產(chǎn)方式產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，通過離心濃縮得到的芽孢桿菌產(chǎn)品，其活菌數(shù)最高可以達到每克一萬億以上。CN101986865A公開了一種地衣芽孢桿菌的制備方法，采用三級液體深層發(fā)酵，連續(xù)補料分批發(fā)酵，芽孢率可以達到90%以上。液體發(fā)酵易于控制，減少污染，但是該專利并未披露利用該技術(shù)發(fā)酵的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)。專利CN1202522A公開了一株地衣芽孢桿菌及其微生態(tài)制劑，該法利用固體發(fā)酵法或者液體發(fā)酵法發(fā)酵地衣芽孢桿菌，操作簡單， 易于實現(xiàn)，但是該法屬于實驗室研發(fā)階段，不利于大生產(chǎn)的推廣。專利CN102021131A公開了一種地衣芽孢桿菌液體制劑的制備方法，液體深層發(fā)酵，活菌數(shù)2 X 109CFU/mL時，獲得所需要的發(fā)酵液，該法制備屬于典型的液體發(fā)酵，發(fā)酵液可用來防治西瓜枯萎病；液體發(fā)酵法不易染菌，但是該工藝制備的活菌數(shù)較低。專利CN102120972A公開了一種地衣芽孢桿菌的制備方法，該法采用三個溫度梯度對地衣芽孢桿菌凍干菌粉進行復(fù)蘇，復(fù)蘇后的地衣芽孢桿菌經(jīng)斜面、三角瓶、發(fā)酵罐后制備發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)60士2°C熱風(fēng)循環(huán)烘干，經(jīng)過三級復(fù)蘇后制備的地衣芽孢桿菌菌粉，活菌數(shù)高，而且該發(fā)酵法后處理操作簡單，但是熱烘干耗時太長，活菌數(shù)損失較大。王新磊等O010)研究了地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵條件，優(yōu)化后產(chǎn)乳酸量高，產(chǎn)酸速率快，但沒有披露活菌數(shù)及芽孢形成率
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌CRVAB001。本發(fā)明的另一目的是提供一種微生態(tài)液體制劑。本發(fā)明的另一目的是提供上述微生態(tài)液體制劑的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種微生態(tài)粉劑。本發(fā)明的另一目的是提供上述微生態(tài)粉劑的制備方法。本發(fā)明分離篩選出一種產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌 CRVAB00KBacillus licheniformis)。該菌株于2011年5月17日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 4850。本發(fā)明提供了一種微生態(tài)液體制劑，包含上述的地衣芽孢桿菌CRVAB001。本發(fā)明還提供了上述微生態(tài)液體制劑的制備方法，包括以下步驟1)菌體一級斜面培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，于 30 45°C下培養(yǎng)18 36小時獲得菌體一級斜面；2)菌體二級液體培養(yǎng)將步驟1)所得菌體一級斜面接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在 30 45°C、150 250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，菌數(shù)彡1.0X 1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得菌液；3)菌體三級種子液培養(yǎng)將步驟2)所得菌液以 5%接種量(重量/重量) 接種于液體培養(yǎng)基，于30 45°C、150 250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)彡1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得種子液；4)液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消20 40min，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中， 通高壓蒸汽升溫至110 130°c，并保溫20 40min，之后通冷卻水冷卻至30 45°C，無菌條件下將步驟幻所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2% 5% (重量/重量)，罐壓0. 03 0. IOMPa,發(fā)酵溫度30 45°C，轉(zhuǎn)速150 250r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵， 發(fā)酵開始的前6小時通氣比為1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵(合理的通氣比保證溶氧值不低于20%，有助于菌體發(fā)酵和芽孢的形成)，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%，9 14小時，溶氧35% ;14小時后停止供氧，間歇攪拌，進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)彡lX101(lCFU/mL，芽孢形成率達到90%以上，乳酸含量彡30g/L，停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液， 獲得微生態(tài)液體制劑。其中，所述斜面培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/ L，水 lOOOmL，pH 7. 0 7. 5，無菌。根據(jù)本發(fā)明的微生態(tài)液體制劑的制備方法，其中，所述液體培養(yǎng)基配方為按重量百分比計算，玉米粉0. 5 % 4. 0 %、豆粕0. 5 % 2. 0 %、魚粉0. 1 % 0. 5 %、葡萄糖 0. 1.0%、硫酸鎂0.01% 0. 1%、硫酸錳 0.01% 0.05%，水余量，pH 7. 0 7. 5，無菌。根據(jù)本發(fā)明的微生態(tài)液體制劑的制備方法，其中，所述液體培養(yǎng)基配方為按重量百分比計算，葡萄糖5 % 10 %、玉米漿0. 03 % 0. 07 %、硫酸銨0. 05 % 0. 20 %、MgSO4 0. 01% 0. 03%, FeSO4 0. 001 0. 003%, NaCl 0. 0. 5%, CaCO3 5%、KH2PO4 0. 06% 0. 16%、水余量，無菌。
本發(fā)明還提供了一種微生態(tài)粉劑，包含上述的地衣芽孢桿菌CRVAB001。本發(fā)明還提供了一種微生態(tài)粉劑的制備方法，包括以下步驟1)菌體一級斜面培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，于 30 45°C下培養(yǎng)18 36小時獲得菌體一級斜面；2)菌體二級液體培養(yǎng)將步驟1)所得菌體一級斜面接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在 30 45°C、150 250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，菌數(shù)彡1.0X 1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得菌液；3)菌體三級種子液培養(yǎng)將步驟幻所得菌液以 5%接種量(重量/重量) 接種于液體培養(yǎng)基，于30 45°C、150 250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)彡1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得種子液；4)液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消20 40min，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中， 通高壓蒸汽升溫至110 130°c，并保溫20 40min，之后通冷卻水冷卻至30 45°C，無菌條件下將步驟幻所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2% 5% (重量/重量)， 罐壓0. 03 0. lOMPa，發(fā)酵溫度30 45°C，轉(zhuǎn)速150 250r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵，發(fā)酵開始的前6小時通氣比為1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%，9 14小時，溶氧35%;14小時后停止供氧，間歇攪拌， 進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)彡lX101(lCFU/mL，芽孢形成率達到90%以上，乳酸含量彡30g/L，停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液。5)鹽析向步驟4)所得發(fā)酵液中加入 5% (g/mL)磷酸氫二鈉、 5% (g/mL)氯化鈣、 5% (g/mL)氫氧化鈉的水溶液，攪拌30 60min ；6)過濾向步驟1)的溶液中加入助濾劑，攪拌10 20min，靜置10 90min，進入板框過濾機過濾，過濾溫度為30 50°C，過濾壓力為3 ^g/cm2，板框過濾的物料水分保持在30% 50% (重量比)，獲得濾餅，其中，所述助濾劑為，按重量百分比計算，1 % 6 %輕質(zhì)碳酸鈣、1 % 5 %珍珠巖和 5%硅藻土中的一種或幾種；將所得濾餅直接進行干燥，優(yōu)選進入閃蒸干燥機干燥，進風(fēng)溫度為120 180°C， 進料速度為80 200r/min，物料出口溫度為60 90°C，最終物料水分為0. 5% 10% (重量比)，獲得微生態(tài)粉劑。本發(fā)明還提供了上述微生態(tài)液體制劑作為飼料添加劑及在改善養(yǎng)殖水體環(huán)境方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述微生態(tài)粉劑作為飼料添加劑及在改善養(yǎng)殖水體環(huán)境方面的應(yīng)用。本發(fā)明的含地衣芽孢桿菌的微生態(tài)液體制劑或粉劑的使用方法為1)將地衣芽孢桿菌液體制劑或粉劑與飼料混合或拌料；在豬的全價料中的添加比例為0. 1%。 2%。(重量/重量)；在肉雞和肉鴨全價料中的添加比例為0. 1%。 2%。(重量/重量)；在蛋雞和蛋鴨料中的添加比例為0.1%。 2%。(重量/重量)；在牛和羊等反芻動物精料中的添加比例為0.2%。 3%。(重量/重量)；在水產(chǎn)動物飼料中的添加比例為 500 IOOOg/(畝 米)；2)也可直接口服或加入水中飲用。
本發(fā)明提供的兩種地衣芽孢桿菌微生態(tài)制劑，它們分別達到了以下的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)液體制劑為棕黃色液體，較濃的酸香味；活菌數(shù)> lX101(lCFU/mL，芽孢形成率彡9O %，乳酸含量彡30g/L ；鉛(以1 計)彡40mg/kg，無機砷(以As計)彡10mg/kg，氟 (以F計)彡1000mg/kg，沙門氏菌未見檢出，符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。粉劑為淡黃白色粉末；活菌數(shù)彡lXlO^CFU/g;干燥粉劑水分含量為0.5% 10% ；鉛(以1 計)彡40mg/kg,無機砷(以As計)彡10mg/kg,氟(以F計)彡IOOOmg/ kg,沙門氏菌未見檢出，符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的含地衣芽孢桿菌的微生態(tài)液體制劑或粉劑及其制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著的優(yōu)點1)本發(fā)明的地衣芽孢桿菌CRVAB001，可分解多種糖產(chǎn)酸，產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶， 耐高溫，耐酸，在高鹽濃度下可以生長；2)本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵法，使得制備工藝的效率得到大大提高，通過進一步優(yōu)化各步驟采用的培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵工藝條件，使得最終產(chǎn)品中的地衣芽孢桿菌的活菌含量被大幅度提高，其中液體制劑中的活菌含量可達lX101(lCFU/mL以上，粉劑中的活菌含量可達lX10"CFU/g以上，充分地保證了地衣芽孢桿菌制劑的有效性；3)本發(fā)明所用地衣芽孢桿菌可高效快速利用葡萄糖等糖源發(fā)酵產(chǎn)乳酸，具有較強的工業(yè)應(yīng)用前景；4)本發(fā)明所用的液體深層發(fā)酵法，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵方式，利于地衣芽孢桿菌產(chǎn)乳酸的積累；5)本發(fā)明制備的地衣芽孢桿菌制劑耐酸、耐膽鹽，在腸道環(huán)境中保持高效穩(wěn)定，為地衣芽孢桿菌制劑的廣泛推廣使用奠定了基礎(chǔ)；6)本發(fā)明的地衣芽孢桿菌制劑中地衣芽孢桿菌的芽孢形成率高，成孢率> 90%, 更耐高溫，便于加工和保存；7)本發(fā)明的地衣芽孢桿菌制劑無毒副作用、無耐藥性、無殘留，成本低、效果顯著；8)本發(fā)明的地衣芽孢桿菌制劑，用作飼料添加劑中可以提高動物生產(chǎn)性能；用在養(yǎng)殖水體中，可改善養(yǎng)殖環(huán)境。


地衣芽孢桿菌CRVAB001 (Bacillus licheniformis)，于 2011 年 5 月 17 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 4850。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例1地衣芽孢桿菌CRVAB001 (Bacillus licheniformis)的菌株分離、純化分別從肉仔雞、蛋雞、仔豬、母豬的胃腸道采集樣品，在實驗室進行微生物分離、 純化，從中分離到114株芽孢桿菌，經(jīng)過耐酸、耐膽鹽、耐蛋白酶及耐溫等抗逆性試驗篩選
7出12株芽孢桿菌，再通過產(chǎn)乳酸試驗篩選出1株高產(chǎn)乳酸菌株，經(jīng)氣相色譜測定其乳酸含量可達20μβ/ιΛ。該菌株編號為CRVAB001，經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)。該菌株于2011年5月17日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 100101)，其保藏編號是=CGMCC No. 4850。實施例2地衣芽孢桿菌CRVAB001 (Bacillus licheniformis)的生物學(xué)特征細菌形態(tài)及理化特征鑒定依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行。該地衣芽孢桿菌 CRVAB001顯微形態(tài)和理化特征試驗結(jié)果如下表1所示。表1地衣芽孢桿菌細菌形態(tài)和理化試驗結(jié)果
試驗項目結(jié)果試驗項目結(jié)果革蘭氏染色陽性碳水化合物產(chǎn)酸細菌形狀桿狀葡萄糖+細胞直徑> ι μ m阿拉伯糖+形成芽孢+木糖+芽孢膨大甘露醇+芽孢圓形乳糖接觸酶+發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣氧化酶+淀粉水解+厭氧生長+酪素水解+VP試驗+利用檸檬酸鹽+VP菌液PH > 750°C生長+VP菌液pH < 6+7% NaCl生長+MR試驗+pH 5. 7生長+硝酸鹽還原試驗+實施例3制備新型地衣芽孢桿菌液劑-Yl1)地衣芽孢桿菌一級斜面培養(yǎng)采用常規(guī)方法將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C下培養(yǎng)36小時得到地衣芽孢桿菌一級斜面；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物(g/L)牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，水1000mL，pH 7. 0 7. 5 ；
2)地衣芽孢桿菌二級液體培養(yǎng)將步驟1)獲得的地衣芽孢桿菌一級斜面接種于液體培養(yǎng)基，在30°C、250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，活菌數(shù)彡IX IO10CFU/ mL時停止培養(yǎng)；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液 (% )玉米粉4.0%、豆粕2.0%、魚粉0.5%、葡萄糖1.0%、硫酸鎂0. 1%、硫酸錳0.05%， pH 7. 0 7. 5 ；3)地衣芽孢桿菌三級種子液培養(yǎng)將步驟2、得到的地衣芽孢桿菌液以1 %接種量 (重量/重量)接種于種子培養(yǎng)基，于30°C、250r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)> lX1010CFU/mL ；按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％ ):玉米粉4.0%、豆粕2.0%、魚粉0. 5%、葡萄糖1.0%、硫酸鎂0. 1%、硫酸錳 0. 05%, pH 7. 0 7. 5 ；4)地衣芽孢桿菌液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消40min，將發(fā)酵培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，然后通高壓蒸汽升溫至110°c，并保溫40min，之后通冷卻水冷卻至30°C，無菌條件下接種入步驟幻所述的地衣芽孢桿菌種子液，接種量為2% (重量/重量)，罐壓0.03MPa， 發(fā)酵溫度30°C，轉(zhuǎn)速250r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵發(fā)酵開始的前6小時通氣比為 1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%， 9 14小時，溶氧35% ； 14小時后停止供氧，間歇攪拌，進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)> 1 X IOltlCFU/ mL,芽孢形成率達到90 %以上，乳酸含量彡30g/L,停止發(fā)酵；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％)葡萄糖10%、玉米漿0.07%、硫酸銨 0. 20%, MgSO4 0. 03%, FeSO4 0. 003%, NaCl 0. 5%, CaCO3 5%, KH2PO4 0.16%。該地衣芽孢桿菌發(fā)酵液可以直接作為地衣芽孢桿菌液體制劑。 實施例4制備地衣芽孢桿菌液體制劑-Y21)地衣芽孢桿菌一級斜面培養(yǎng)采用常規(guī)方法將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基，于45°C下培養(yǎng)18小時得到地衣芽孢桿菌一級斜面；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物(g/L)牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，水1000mL，pH 7. 0 7. 5 ；2)地衣芽孢桿菌二級液體培養(yǎng)將步驟1)獲得的地衣芽孢桿菌一級斜面接種于液體培養(yǎng)基，在45°C、150r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，活菌數(shù)彡IX IO10CFU/ mL時停止培養(yǎng)；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液 (%)玉米粉0. 5%、豆粕0. 5%、魚粉0. 1%、葡萄糖0. 1%、硫酸鎂0.01%、硫酸錳0.01%， pH 7. 0 7. 5 ；3)地衣芽孢桿菌三級種子液培養(yǎng)將步驟幻得到的地衣芽孢桿菌液以5%接種量 (重量/重量)接種于種子培養(yǎng)基，于45°C、150r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)> lX1010CFU/mL ；按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):玉米粉0.5%、豆粕0.5%、魚粉0. 1%、葡萄糖0. 1%、硫酸鎂0.01%、硫酸錳 0. 01%, pH 7. 0 7. 5 ；4)地衣芽孢桿菌液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消20min，將發(fā)酵培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，然后通高壓蒸汽升溫至130°C，并保溫20min，之后通冷卻水冷卻至45°C，無菌條件下接種入步驟幻所述的地衣芽孢桿菌種子液，接種量為5% (重量/重量)，罐壓0. IOMPa, 發(fā)酵溫度45°C，轉(zhuǎn)速150r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵發(fā)酵開始的前6小時通氣比為1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%， 9 14小時，溶氧35%;14小時后停止供氧，間歇攪拌，進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)> IX IOltlCFU/ mL,芽孢形成率達到90 %以上，乳酸含量彡30g/L,停止發(fā)酵；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):葡萄糖5%、玉米漿0.03%、硫酸銨 0. 05%, MgSO4 0. 01%, FeSO4 0. 001%, NaCl 0.1%, CaCO3 1 %> KH2PO4 0.06%。該地衣芽孢桿菌發(fā)酵液可以直接作為地衣芽孢桿菌液體制劑。實施例5制備地衣芽孢桿菌液體制劑-Y31)地衣芽孢桿菌一級斜面培養(yǎng)采用常規(guī)方法將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基，于35°C下培養(yǎng)20小時得到地衣芽孢桿菌一級斜面；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物(g/L)牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，水1000mL，pH 7. 0 7. 5 ；2)地衣芽孢桿菌二級液體培養(yǎng)將步驟1)獲得的地衣芽孢桿菌一級斜面接種于液體培養(yǎng)基，在35°C、200r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，活菌數(shù)彡IX IO10CFU/ mL時停止培養(yǎng)；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液 (%)玉米粉3.0%、豆粕1.0%、魚粉0.3%、葡萄糖0.5%、硫酸鎂0. 05%、硫酸錳0.03%， pH 7. 0 7. 5 ；3)地衣芽孢桿菌三級種子液培養(yǎng)將步驟幻得到的地衣芽孢桿菌液以3%接種量 (重量/重量)接種于種子培養(yǎng)基，于35°C、200r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)> lX1010CFU/mL ；按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):玉米粉3.0%、豆粕1.0%、魚粉0.3%、葡萄糖0.5%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳 0. 03%, pH 7. 0 7. 5 ；4)地衣芽孢桿菌液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消30min，將發(fā)酵培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，然后通高壓蒸汽升溫至，并保溫30min，之后通冷卻水冷卻至35°C，無菌條件下接種入步驟幻所述的地衣芽孢桿菌種子液，接種量為3% (重量/重量)，罐壓0.06MPa， 發(fā)酵溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵發(fā)酵開始的前6小時通氣比為 1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%， 9 14小時，溶氧35% ； 14小時后停止供氧，間歇攪拌，進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)> 1 X IOltlCFU/ mL,芽孢形成率達到90 %以上，乳酸含量彡30g/L,停止發(fā)酵；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):葡萄糖7%、玉米漿0.05%、硫酸銨 0. 15%, MgSO4 0. 02%, FeSO4 0. 002%, NaCl 0. 3%, CaCO3 3%, KH2PO4 0.11%。該地衣芽孢桿菌發(fā)酵液可以直接作為地衣芽孢桿菌液體制劑。 實施例6制備地衣芽孢桿菌液體制劑-Y41)地衣芽孢桿菌一級斜面培養(yǎng)采用常規(guī)方法將地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C下培養(yǎng)M小時得到地衣芽孢桿菌一級斜面；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物(g/L)牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，水1000mL，pH 7. 0 7. 5 ；2)地衣芽孢桿菌二級液體培養(yǎng)將步驟1)獲得的地衣芽孢桿菌一級斜面接種于液體培養(yǎng)基，在37°C、210r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌液，活菌數(shù)彡IX IO10CFU/ mL時停止培養(yǎng)；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％ )玉米粉3.2%、豆粕1.5%、魚粉0.3%、葡萄糖0.5%、硫酸鎂0.015%、硫酸錳 0. 03%, pH 7. 0 7. 5 ；3)地衣芽孢桿菌三級種子液培養(yǎng)將步驟幻得到的地衣芽孢桿菌液以2%接種量 (重量/重量)接種于種子培養(yǎng)基，于37°C、210r/min的條件下培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌種子液，活菌數(shù)> lX1010CFU/mL ；按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):玉米粉3.0%、豆粕1.5%、魚粉0.3%、葡萄糖0.5%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳 0. 03%, pH 7. 0 7. 5 ；4)地衣芽孢桿菌液體發(fā)酵先用蒸汽對罐體空消30min，將發(fā)酵培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，然后通高壓蒸汽升溫至121°C，并保溫30min，之后通冷卻水冷卻至37°C，無菌條件下接種入步驟幻所述的地衣芽孢桿菌種子液，接種量為2% (重量/重量)，罐壓0.05MPa， 發(fā)酵溫度37°C，轉(zhuǎn)速210r/min，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵發(fā)酵開始的前6小時通氣比為 1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，進行需氧發(fā)酵，需氧發(fā)酵階段，0 8小時，溶氧20%， 9 14小時，溶氧35% ； 14小時后停止供氧，間歇攪拌，進行厭氧發(fā)酵，活菌數(shù)> 1 X IOltlCFU/ mL,芽孢形成率達到90 %以上，乳酸含量彡30g/L,停止發(fā)酵；其中，按重量百分比計算，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液(％):葡萄糖8%、玉米漿0.05%、硫酸銨 0. 10%,MgSO4 0. 02%,FeSO4 0. 001%,NaCl 0. 2%,CaCO3 3%,KH2PO4 0.132%。該地衣芽孢桿菌發(fā)酵液可以直接作為地衣芽孢桿菌液體制劑。實施例7制備地衣芽孢桿菌粉劑-Fl向?qū)嵤├?制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中加(g/mL)磷酸氫二鈉、(g/mL) 氯化鈣、(g/mL)氫氧化鈉的水溶液后，攪拌30min，再加入輕質(zhì)碳酸鈣、珍珠巖， 攪拌lOmin，靜置lOmin，然后進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為30°C，過濾壓力為3kg/ cm2，板框過濾的物料水分保持在50% (重量比)；板框過濾后的濾餅直接進入閃蒸干燥機進行干燥，進風(fēng)溫度為180°C，進料速度為200r/min，物料出口溫度為90°C，最終物料水分為10% (重量比)，得到的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)彡lX10"CFU/g。實施例8制備地衣芽孢桿菌粉劑-F2向?qū)嵤├?制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中加5% (g/mL)磷酸氫二鈉、5% (g/mL) 氯化鈣、5% (g/mL)氫氧化鈉的水溶液后，攪拌60min，再加入6%輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土， 攪拌20min，靜置90min，然后進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為50°C，過濾壓力為^g/ cm2，板框過濾的物料水分保持在30% (重量比)；板框過濾后的濾餅直接進入閃蒸干燥機進行干燥，進風(fēng)溫度為120°C，進料速度為80r/min，物料出口溫度為60°C，最終物料水分為 0.5% (重量比)，得到的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)彡lX10"CFU/g。實施例9制備地衣芽孢桿菌粉劑-F3向?qū)嵤├?制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中加3% (g/mL)磷酸氫二鈉、3% (g/mL) 氯化鈣、3% (g/mL)氫氧化鈉的水溶液后，攪拌30min，再加入珍珠巖、5%硅藻土，攪拌 20min，靜置40min，然后進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為40°C，過濾壓力為4kg/cm2， 板框過濾的物料水分保持在38%重量比)；板框過濾后的濾餅直接進入閃蒸干燥機進行干燥，進風(fēng)溫度為160°C，進料速度為150r/min，物料出口溫度為80°C，最終物料水分為2% (重量比)，得到的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)彡IX 10"CFU/g。實施例10制備地衣芽孢桿菌粉劑-F4
向?qū)嵤├?制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中加5% (g/mL)磷酸氫二鈉、5% (g/mL) 氯化鈣、5% (g/mL)氫氧化鈉的水溶液后，攪拌30min，再加入2%輕質(zhì)碳酸鈣、5%珍珠巖， 攪拌20min，靜置20min，然后進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為42°C，過濾壓力為4kg/ cm2，板框過濾的物料水分保持在35% (重量比)；板框過濾后的濾餅直接進入閃蒸干燥機進行干燥，進風(fēng)溫度為160°C，進料速度為200r/min，物料出口溫度為85°C，最終物料水分為(重量比)，得到的地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)彡lX10"CFU/g。實施例11地衣芽孢桿菌粉劑的安全性研究將地衣芽孢桿菌CRVAB001活化后接種于液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh，取100 μ L菌液滴加到血平板中，37°C培養(yǎng)4 后觀察有否透明圈。選21日齡北京當(dāng)?shù)夭耠u雛雞180只， 隨機分為2組(試驗組和對照組)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30只雞，試驗組雞每只肌肉注射ImL地衣芽孢桿菌CRVAB001 (1. 5 X 109CFU/mL)，另外每只每天口服1. 5 X 109CFU/mL地衣芽孢桿菌CRVAB001菌液ImL ；對照組每只雞注射ImL蒸餾水并每天口服ImL地衣芽孢桿菌 CRVAB001的培養(yǎng)基，14天后解剖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血平板培養(yǎng)未見溶血現(xiàn)象；試驗組雞只健康及精神狀態(tài)良好，采食、飲水、糞便均正常，動物無死亡，14天內(nèi)未見中毒癥狀；試驗組雞只解剖時亦未發(fā)現(xiàn)雞只膀胱、肝總管結(jié)石；試驗組雞只血常規(guī)各項指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)(見表2)，與對照組之間均無顯著性差異；鏡下觀察試驗組肝、脾、腎、法氏囊、十二指腸等均未見病理改變。說明地衣芽孢桿菌CRVAB001對動物安全，無毒副作用，可以在飼料添加劑中放心使用。表2地衣芽孢桿菌安全性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌CRVAB001 (Bacillus licheniformis)，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 4850。
2.一種微生態(tài)液體制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌CRVAB001。
3.—種微生態(tài)液體制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)菌體一級斜面培養(yǎng)將保藏編號為CGMCCNo. 4850的地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得菌體一級斜面；2)菌體二級液體培養(yǎng)將步驟1)所得菌體一級斜面接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，活菌數(shù)≥1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得菌液；3)菌體三級種子液培養(yǎng)將步驟幻所得菌液接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，活菌數(shù)≥1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得種子液；4)液體發(fā)酵將步驟幻所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵，發(fā)酵開始的前6小時通氣比為1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，活菌數(shù)彡IXIOiciCFU/mL,芽孢形成率達到90 %以上，乳酸含量彡30g/L,停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液，獲得微生態(tài)液體制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生態(tài)液體制劑的制備方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基配方為按重量百分比計算，玉米粉0. 5% 4. 0%、豆粕0. 5% 2. 0%、魚粉0. 1% 0.5%、葡萄糖0. 1 % 1.0%、硫酸鎂0.01% 0. 1 %、硫酸錳0.01% 0.05%，水余量，pH 7. 0 7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生態(tài)液體制劑的制備方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基配方為按重量百分比計算，葡萄糖5 % 10 %、玉米漿0. 03 % 0. 07 %、硫酸銨0. 05 % 0. 20%, MgSO4 0. 01 % 0. 03 %、FeSO4 0. 001 0. 003 %、NaCl 0. 1 % 0. 5 %、CaCO35%, KH2PO4 0·06% 0· 16%、水余量。
6.一種微生態(tài)粉劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌CRVAB001。
7.—種微生態(tài)粉劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)菌體一級斜面培養(yǎng)將保藏編號為CGMCCNo. 4850的地衣芽孢桿菌CRVAB001接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得菌體一級斜面；2)菌體二級液體培養(yǎng)將步驟1)所得菌體一級斜面接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，活菌數(shù)≥1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得菌液；3)菌體三級種子液培養(yǎng)將步驟幻所得菌液接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，活菌數(shù)≥1.0X1010CFU/mL時停止培養(yǎng)，獲得種子液；4)液體發(fā)酵將步驟幻所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用需氧一厭氧轉(zhuǎn)換發(fā)酵，發(fā)酵開始的前6小時通氣比為1 0.8，7 14小時通氣比為1 1，活菌數(shù)彡IXIOiciCFU/mL，芽孢形成率達到90%以上，乳酸含量彡30g/L，停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液；5)鹽析向步驟4)所得發(fā)酵液中加入 5%(g/mL)磷酸氫二鈉、1 % 5% (g/mL)氯化鈣、 5% (g/mL)氫氧化鈉的水溶液，攪拌；6)向步驟1)的溶液中加入助濾劑，攪拌，靜置，過濾，獲得濾餅，經(jīng)干燥獲得微生態(tài)粉劑，其中，所述助濾劑為，按重量百分比計算， 6%輕質(zhì)碳酸鈣、 5%珍珠巖和 5%硅藻土中的一種或幾種。
8.權(quán)利要求2所述微生態(tài)液體制劑作為飼料添加劑及在改善養(yǎng)殖水體環(huán)境方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述微生態(tài)粉劑作為飼料添加劑及在改善養(yǎng)殖水體環(huán)境方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌及其制劑和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵后高產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)，其保藏編號為CGMCC No.4850。本發(fā)明還提供了一種微生態(tài)液體制劑，包含上述的地衣芽孢桿菌。本發(fā)明還提供了一種上述微生態(tài)液體制劑的制備方法。本發(fā)明還提供了一種微生態(tài)粉劑，包含上述的地衣芽孢桿菌。本發(fā)明還提供了一種上述微生態(tài)粉劑的制備方法。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌可高效快速發(fā)酵產(chǎn)乳酸，具有較強的工業(yè)應(yīng)用前景。本發(fā)明液體制劑中的活菌含量可達1×1010CFU/mL以上，粉劑中的活菌含量可達1×1011CFU/g以上，充分地保證了地衣芽孢桿菌制劑的有效性。
文檔編號A23K1/16GK102559560SQ20121004291
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者吳培均, 姚琨, 李兆勇, 李富偉, 楊忠廣 申請人:北京科為博生物科技有限公司