專利名稱：甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA及其克隆方法與重組應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域中的克隆、表達技術，具體涉及甘蔗條螟生長發育關鍵基因——蛻皮調節轉錄因子CSHR3基因克隆及細菌介導RNAi技術表達CsHR3 dsRNA,來沉默甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子CsHR3基因，使甘蔗條螟不能蛻皮或破壞其正常生長發育過程。
背景技術：
隨著世界人ロ的急劇增長，如何提高農作物產量是一個迫在眉睫的問題。據統計， 因蟲害引起的糧食損失占整個糧食收成的20%。因此，如何有效控制蟲害是提高作物產量的ー個重要因素。大量使用化學農藥雖然可以抑制蟲害，但容易引起昆蟲的抗性，而且對環境破壞極大，不利于人類的可持續發展。隨著生物技術的快速發展，通過轉基因方法改造植物，提高植物自身的抗蟲害能力已成為農作物育種的主流。上世紀九十年代，科學家們利用轉基因手段使農作物表達Bt蛋白以提高農作物對農業害蟲的生物防治在全球被廣泛使用。然而，最近的研究發現有些昆蟲的中腸上皮細胞中丟失了一類能與Bt蛋白結合的受體而使昆蟲對Bt蛋白產生了抗性。最近，在農業上RNAi技術已發展成為一種控制蟲害、提高作物品質的新方法。RNA干擾(RNAi)是ー種新發現的基因調控機制。人們從植物的基因表達共抑制和真菌的抑菌作用現象發現了 RNA干擾這ー古老的生物體基因調控機制。早在1998年，Fire 等人發現雙鏈RNA (dsRNA)可導致靶基因的表達抑制。不久，RNA干擾已發展成為ー種成熟技術，被廣泛應用于靶基因的功能研究中。在昆蟲中，通過dsRNA誘導的RNA干擾(RNAi) 可用來研究昆蟲基因的功能。尤其是近年來，細菌介導或植物介導RNAi表達dsRNA的方法已在多種昆蟲中誘導靶標基因的沉默。然而，還有很多科學問題需要去探討和研究，如通過 RNAi介導沉默害蟲非中腸基因能否誘導害蟲死亡表型的出現；RNAi介導表達dsRNA量與害蟲死亡表型或生長發育阻礙是否呈正相關；RNAi介導沉默靶標基因的周期與害蟲生測表型之間的相關性；選擇哪ー靶標基因在害蟲生物防治中周期短、生測效果好、更加高效等， 這ー系列問題都需要在試驗探索和研究中驗證。RNAi技術在昆蟲中研究功能基因的方法主要是注射法，一般通過把預干擾靶標基因dsRNA或SiRNA用微量注射器導入昆蟲的胚胎或體腔，從而實現對靶標基因mRNA表達的抑制。注射法RNAi雖然在昆蟲功能基因方面取得了巨大的成績，但也存在以下諸多問題: 首先，注射法RNAi對實驗操作人員技術要求很高、難度大、強度大，極易因操作不當而導致數據不準及昆蟲死亡。其次，注射法RNAi制備dsRNA或SiRNA均需要借助昂貴的國外試劑盒完成，增加了實驗成本，所制備dsRNA或siRNA的量卻很少。最后，注射法RNAi往往需要對單ー昆蟲逐個進行注射操作，為其廣泛應用田間害蟲生物防治増加了難度。為了能滿足方便地研究昆蟲功能基因需要，特別是為探索新的害蟲生物防治方法，需要更好的細菌介導或植物介導RNAi技術在昆蟲功能基因研究應用。
蛻皮調節轉錄因子是ー類同時啟動蛻皮早期基因簇表達，又抑制蛻皮晚期基因簇表達的調節因子，在昆蟲蛻皮過程中發揮重要的基因表達調控作用。現有研究發現，可從多種昆蟲中獲得家族的生長發育關鍵基因，如棉鈴蟲がぬ J、煙草天蛾i&K 、果蠅
等。Josefa等從德國小蠊中克隆到蛻皮調節轉錄因子汝ガ似，并通過RNAi技術抑制汝ガ似基因表達，結果發現幼蟲不能脫掉舊表皮，發生皮層溶離，表明取*K 基因直接參與德國小蠊幼蟲蛻皮。昆蟲若不能正常蛻皮，則無法變成成蟲，從而形成取食量降低、沒有生命力甚至死亡表型的個體。蛻皮調節轉錄因子是蛻皮過程中關鍵因子，同時也受到機體相關基因的嚴格調控，當表達水平降低或異常提高時都會影響昆蟲的正常蛻皮。因此，打破蛻皮基因的平衡，干擾昆蟲蛻皮，破壞其正常的生長發育過程，可達到殺滅害蟲和控制害蟲種群的目的。國外已對果蠅、煙草天蛾、德國小蠊等蛻皮調節轉錄因子進行了基因克隆和作用機理研究。其中果蠅的/研究較為深入，該基因在果蠅蛻皮和變態生長發育中起關鍵作用。GenBank數據庫中目前尚無關于甘蔗條螟蛻皮調節因子基因的記錄和研究報道。

發明內容
本發明目的在于提供ー種從甘蔗條螟幼蟲中提取的甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子 cDNA，并提供甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA的克隆方法以及重組應用，還提供了ー種細菌介導RNAi技術防治甘蔗條螟的新方法。為實現上述目的，本發明采取如下技術方案
本發明從甘蔗條螟中克隆到甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子6 / 基因的cDNA，它具有 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示的序列
(I)SEQ ID NO. I 的信息
(a)序列特征
*長度1266堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓撲結構線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設否
(d)反義否
(e)最初來源甘鹿條螟(CXiirOsacchariphagus)
(f)序列描述SEQID NO. I
權利要求
1.一種甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所述。
2.權利要求I所述甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子，其氨基酸序列如SEQID NO. 2 所述。
3.權利要求I所述甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA的克隆方法，包括以下步驟(O從甘蔗條螟預蛹期幼蟲提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA ；(2)根據不同鱗翅目昆蟲蛻皮調節轉錄因子的保守序列設計簡并引物CsHR3-middle fragment-Pl 5' -ACAGffGGTGAACTACCAGTG -3’CsHR3-middle fragment-P2 :5’-GACCATGRAATTGGTCGCT-3’(3)以cDNA為模板，PCR擴增甘蔗條螟CsHR3基因的中間片段；(4)純化步驟(3)所得PCR產物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產物連接到PMD19-T simple載體上，然后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，37°C平板培養，藍白斑篩選含中間片段的陽性克隆子；(5)根據CsHR3中間片段的測序結果，設計3’RACE特異性引物，以甘蔗條螟cDNA為模板，PCR擴增CsHR3基因的3’片段序列；CsHR3-3’ RACE-GSPI :5’ - CGGGTCAACAGGAATAGATGTCA -3’CsHR3-3’ RACE-GSP2 :5’- CAGCGCCTGACTCAGTGTATGAC-3’(6)純化步驟(5)所得PCR產物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產物連接到PMD19-T 載體上，然后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，37°C平板培養，藍白斑篩選獲得CsHR3基因 3’端的陽性克隆子；(7)將步驟(4)和(6)所得的陽性克隆子進行序列測定，然后將測定所得序列通過生物信息學軟件DNAman拼接，得到CsHR3基因1266 bp序列。
4.如權利要求3所述甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA的克隆方法，其特征在于，所述步驟(I)中反轉錄合成cDNA具體為取總RNA 5微升、Random引物I微升、底物dNTPs 2 微升，用RNase-free H2O加至10微升,混勻，65°C保溫5min,迅速放至冰上冷卻3min ;然后在上述混合物中加入5 X Primer Script Buffer 4微升、RNA酶抑制劑O. 5微升、AMV反轉錄酶O. 5微升，并用RNase-free H2O加至20微升，42°C反應60min，70°C滅火15min，4°C冷卻，-20°C保存備用。
5.如權利要求3所述甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA的克隆方法，其特征在于，步驟(3)和(5)中PCR擴增所用的反應試劑組成及反應條件如下首先將下述試劑混合在一起，模板 cDNAIM-I脫氧核苷酸底物dNTP4μ1Ex-Taq DNA 聚合酶O. 5μ1 IOXTaq DNA聚合酶緩沖液5μ1正向引物(ΙΟμΜ)2μ1反向引物(ΙΟμΜ)2μ1ddH2035. 5μ1總體積50μ1反應條件為首先94°C預變性3分鐘；然后進行如下循環94°C 30秒，50°C 30秒，720C 2分鐘，共進行32循環；最后72°C延伸10分鐘。
6.權利要求I所述甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子cDNA的重組應用，采用細菌介導RNAi 技術在RNaseIII缺陷型大腸桿菌HTl 15中表達dsRNA，獲得具有生物活性的dsRNA，通過飼喂甘蔗條螟幼蟲，來沉默甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子CsHR3基因，使甘蔗條螟不能蛻皮或破壞其正常生長發育過程，從而用于甘蔗條螟害蟲的生物防治；或者通過基因工程方法將甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子轉入作物，獲得具有抗蟲能力的作物。
7.—種細菌介導RNAi防治甘鹿條螟的方法,其特征在于,選擇甘鹿條螟脫皮調節轉錄因子CsHR3基因作為靶標，選定其CsHR3基因上含有非LBD功能結構域和LBD功能結構域的兩個dsRNA干擾片段，構建細菌介導的RNAi重組載體L4440-CsHR3_I I、L4440-CsHR3_I2， 同時選用綠色熒光蛋白基因EGFP作為陰性對照，清水作為負對照；通過熱激法將上述載體導}KEcoli. HT115 (8似86 111缺陷型大腸桿菌)中，加入0.8禮IPTG進行誘導表達，提取細菌表達dsRNA進行甘蔗條螟幼蟲的飼喂試驗，記錄3齡和5齡甘蔗條螟飼喂7天后表型變化及體內CsHR3基因mRNA降低水平。
全文摘要
本發明屬于生物基因工程領域，甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子CsHR3具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。本發明克隆方法是從甘蔗條螟預蛹期幼蟲中提取總RNA，反轉錄合成cDNA；根據不同鱗翅目昆蟲蛻皮調節轉錄因子的保守序列設計簡并引物，PCR擴增甘蔗條螟CsHR3基因的中間片段，再通過3’-RACE技術設計特異性引物，成功獲得CsHR3基因1266bp片段。本發明采用細菌介導RNAi技術在RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌HT115中表達dsRNA，獲得具有生物活性的dsRNA，通過飼喂甘蔗條螟幼蟲來沉默甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子CsHR3基因，使甘蔗條螟不能蛻皮或破壞其正常生長發育過程，從而用于甘蔗條螟害蟲的生物防治；或者通過基因工程方法將甘蔗條螟蛻皮調節轉錄因子轉入作物，獲得具有抗蟲能力的作物。
文檔編號A23K1/16GK102586259SQ20121005961
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者余乃通, 劉志昕, 張樹珍, 張雨良, 熊國如, 王俊剛, 王健華 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所