專利名稱：一種獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得蘭科植物種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，具體來說涉及一種在兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)原生地誘導(dǎo)種子萌發(fā),獲得原球莖,再從原球莖中分離、培養(yǎng)和篩選出對(duì)種子萌發(fā)有效共生真菌的方法。
背景技術(shù)：
蘭科植物的種子非常細(xì)小，僅有發(fā)育不完全的胚，在自然條件下種子萌發(fā)需要依靠特定的共生真菌來獲取營養(yǎng)物質(zhì)。目前蘭科植物種子的萌發(fā)，多采用人工培養(yǎng)基在無菌條件下進(jìn)行非共生萌發(fā)，萌發(fā)率雖高，但在進(jìn)行瀕危種類野外回歸時(shí)，幼苗移植到自然環(huán)境中存活率較低，并且由于無法與自然界中的真菌建立共生關(guān)系從而導(dǎo)致后續(xù)生長(zhǎng)嚴(yán)重受限。通過種子和其有效萌發(fā)真菌在自然條件下的共生萌發(fā)能很好的解決這ー問題。有效真菌的獲得目前多采用從蘭科植物野生植株的根中分離。但由于蘭科植物根中存在著大量作用未知的內(nèi)生真菌，這使得種子萌發(fā)有效真菌的篩選和分離變得復(fù)雜而繁瑣。同時(shí)，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發(fā)階段的有效共生真菌是否相同目前仍不確定。因此，獲得種子萌發(fā)的有效共生真菌是開展珍稀瀕危蘭科植物回歸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，為實(shí)現(xiàn)兜唇石斛的野外回歸創(chuàng)造條件。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案主要是基于以下認(rèn)識(shí)。我們將兜唇石斛的種子放入特制的種子袋中，并將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長(zhǎng)的原生地，誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人エ培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)原球莖中的內(nèi)生真菌生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出菌絲時(shí)，進(jìn)行真菌的純化，獲得純菌落，并進(jìn)行真菌的分子鑒定和保存。將獲得的真菌和兜唇石斛的種子進(jìn)行共生萌發(fā)培養(yǎng)，設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)所獲得的真菌對(duì)兜唇石斛的種子萌發(fā)的有效性，結(jié)果表明所獲得的真菌是兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真菌，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。一種獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，包括以下步驟(I)在兜唇石斛花期進(jìn)行人工異交授粉，果實(shí)成熟但果莢尚未裂開時(shí)收獲果實(shí)，將種子干燥后置于無菌的密閉玻璃容器中在-20°C條件下保存，待用；(2)用滅菌的鑷子將100 200粒兜唇石斛的種子播種在尼龍網(wǎng)布上，將播好種子的尼龍網(wǎng)布對(duì)折，用熱封機(jī)將三邊封起來，制作完成種子袋，在種子袋邊緣縫上標(biāo)簽，便于監(jiān)測(cè)和回收； (3)選擇有兜唇石斛成年植株自然生長(zhǎng)的不同地點(diǎn)，將種子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹干上，在種子袋上面覆蓋ー層苔蘚保濕；
種子袋放置時(shí)應(yīng) 盡量靠近成年植株根部，并使種子袋呈水平狀態(tài)，避免種子在重力作用下聚集成團(tuán)。(4)每個(gè)月定期從各放置點(diǎn)回收2 3個(gè)種子袋，檢查種子袋內(nèi)種子的萌發(fā)情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有原球莖時(shí)，回收所有的種子袋；(5)將回收的原球莖依次用自來水沖洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗后切成兩半，切口面貼于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA上進(jìn)行培養(yǎng)；(6)原球莖切口處長(zhǎng)出菌絲時(shí)，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移3 5次后，得到純菌落；(7)將兜唇石斛的種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液，在配制好的燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA)的培養(yǎng)皿表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養(yǎng)基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理組，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng);(8)每周觀察I次不同處理的種子，記錄種子萌發(fā)數(shù)量及萌發(fā)時(shí)間，對(duì)種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進(jìn)行分級(jí)，記錄每一階段內(nèi)種子或原球莖的數(shù)量，通過和不接菌處理組的對(duì)比，篩選出兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真菌。上述步驟中，所述的種子袋采用網(wǎng)孔為45 μ m的尼龍網(wǎng)布。這樣的網(wǎng)孔大小既可以保持種子不掉出，又可以使水和真菌的菌絲自由穿過，熱封機(jī)封口時(shí)應(yīng)避免損傷種子。步驟(3)中所述的種子袋放置點(diǎn)為同時(shí)有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗處。步驟(4)回收后的種子袋用自來水輕輕沖洗掉附著物及泥土，將清洗后的種子袋放在兩層面巾紙中間，輕輕按壓使面巾紙吸干種子袋多余的水分，用剪刀小心的剪開封口，打開種子袋放在解剖鏡下觀察種子萌發(fā)情況。步驟(5)所述的次氯酸鈉溶液有效氯離子濃度為1%，消毒3 5分鐘，無菌水沖洗3 4次；本步驟同時(shí)設(shè)置對(duì)照處理，用同一來源的原球莖表面滅菌后不切開直接置于PDA培養(yǎng)基中，若對(duì)照組培養(yǎng)基內(nèi)未長(zhǎng)出真菌，說明從實(shí)驗(yàn)組原球莖切口周圍長(zhǎng)出的真菌為原球莖的內(nèi)生共生真菌。培養(yǎng)皿用封口膜封好后放入人工氣候箱內(nèi)，25 ± 2 °C黑暗培養(yǎng)。步驟(7)所述的150微升的懸浮液約含150粒兜唇石斛種子，所述的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為 2000Lx-3000Lx，溫度 25°C ±2°C，光周期 12h/12hL/D。步驟(8)所述的種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況參照Stewart & Zettler (2002)的方法對(duì)種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進(jìn)行分級(jí)，分為5個(gè)階段階段O描述為種胚透明，種皮完好，種子未萌發(fā)，階段I描述為種胚吸水膨脹；階段2描述為種胚繼續(xù)膨大，突破種皮，視為萌發(fā)；階段3描述為出現(xiàn)原生分生組織；階段4描述為長(zhǎng)出第一片葉片；階段5描述為第一片葉片繼續(xù)生長(zhǎng)，變長(zhǎng)。Stewart SL,Zettler Lff(2002)Symbiotic germination of three semi-aquaticrein orchids (Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis) from Florida.(佛羅里達(dá)三種半水生玉鳳花屬植物(Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis)的種子共生萌發(fā))Aquatic Botany (水生植物學(xué))，72，25-35。對(duì)所獲得的兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌進(jìn)行分子鑒定和比對(duì)，其為膠膜菌屬(Tulasenlla)真菌,且與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登錄號(hào)為⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最為相似,最大相似度達(dá)到99%，對(duì)其編號(hào)為FDaI7，采用試管斜面法保存于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園。所述的分子鑒定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR擴(kuò)增所用引物為ITSl和ITS4 ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為上海生エ生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)雖然國內(nèi)外都有專利和文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)蘭科植物種子萌發(fā)有效共生真菌的分離方法，但這些方法多采用從蘭科植物野生植株的根中分離真菌。由于蘭科植物根中存在著大量作用未知的內(nèi)生真菌，這使得種子萌發(fā)有效共生真菌的篩選和分離工作異常復(fù)雜和繁瑣。同時(shí)，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發(fā)階段的 有效共生真菌是否相同并不確定，要獲得種子萌發(fā)有效共生真菌非常困難。對(duì)兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的分離尚無報(bào)道。本發(fā)明的方法直接從兜唇石斛種子原地共生萌發(fā)的原球莖中分離真菌，操作簡(jiǎn)單，獲得的真菌種類單一，不需要大量繁瑣的篩選過程，分離到的ー種膠膜菌屬真菌通過和種子的共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，證明是兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真菌，從而為利用兜唇石斛種子和真菌共生萌發(fā)來培育種苗開辟了一條新的途徑。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步地詳細(xì)說明，但實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制。所有基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I :兜唇石斛開花時(shí)選取健壯的植株進(jìn)行人工異交授粉，授粉后約180天果實(shí)成熟，采收已成熟但果莢尚未裂開的果實(shí)，表面用75%的酒精消毒并用無菌水清洗后用無菌刀片切開果實(shí)，將種子置于盛有硅膠的干燥器內(nèi)干燥24小時(shí)后，于無菌的密閉玻璃小瓶?jī)?nèi)保存于-20°C中。用滅菌的鑷子將100-200粒兜唇石斛的種子均勻播種在6cmX9cm，網(wǎng)孔為45 y m的尼龍網(wǎng)布上，將播好種子的尼龍網(wǎng)布對(duì)折，用熱封機(jī)將三邊封起來，制作完成一個(gè)種子袋，在種子袋邊緣縫上塑料標(biāo)簽，便于監(jiān)測(cè)和回收。選取中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園內(nèi)4個(gè)種子袋放置點(diǎn)和西雙版納國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)綠石林森林公園3個(gè)種子袋放置點(diǎn)，共計(jì)7個(gè)種子袋放置點(diǎn)。這些選取的放置點(diǎn)都有兜唇石斛自然生長(zhǎng)的成年植株，且植株生長(zhǎng)狀況良好，能正常開花結(jié)實(shí)。每個(gè)放置點(diǎn)各放置30個(gè)種子袋，共計(jì)210個(gè)種子袋，種子袋進(jìn)行編號(hào)。將種子袋放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹干上，用尼龍線固定，在種子袋上面覆蓋ー層苔蘚，以起到保濕的作用。放置時(shí)種子袋盡量靠近成年植株根部，使種子袋呈水平狀態(tài)，避免種子在重力作用下聚集成團(tuán)。種子袋放置兩個(gè)月后，每個(gè)月從不同放置點(diǎn)各回收2-3個(gè)種子袋，回收后的種子袋用自來水輕輕沖洗掉附著物及泥土，將清洗后的種子袋放在兩層面巾紙中間，輕輕按壓使面巾紙吸干種子袋多余的水分，用剪刀小心的剪開封ロ，打開種子袋放在解剖鏡下觀察種子萌發(fā)情況。當(dāng)發(fā)現(xiàn)有原球莖時(shí)，于2011年8月20日回收所有剰余的種子袋。從4個(gè)放置點(diǎn)共獲得55粒原球莖，其余3個(gè)放置點(diǎn)種子袋內(nèi)沒有原球莖或種子袋破損。將原球莖用自來水沖洗后，在超凈工作臺(tái)中放入盛有有效氯離子濃度為1%的次氯酸鈉溶液的燒杯中，輕輕搖動(dòng)燒杯3-5分鐘后，用無菌鈍頭鑷子取出，再用無菌水沖洗3-4次。用無菌刀片將每個(gè)原球莖切成兩半，切口面貼于準(zhǔn)備好的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)上進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)將2個(gè)表面消毒的原球莖不切開直接置于PDA培養(yǎng)基中，作為對(duì)照。培養(yǎng)皿用封口膜封好后放入人工氣候箱內(nèi)，25±2°C黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，未切開的原球莖周圍未長(zhǎng)出菌絲，而切開的原球莖周圍長(zhǎng)出白色菌絲，由此可以確定為兜唇石斛原球莖的內(nèi)生真菌。原球莖切口處長(zhǎng)出菌絲時(shí)，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移3-5次后，得純菌落。將保存的兜唇石斛種子從-20°C中取出，置于室溫下過夜使種子回復(fù)室溫。用有效氯離子濃度為I %的次氯酸鈉溶液對(duì)種子進(jìn)行滅菌并用無菌水漂洗3-4次后，將種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液。在配制好的燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA)的培養(yǎng)皿表面放置兩張
I.5cmX4cm大小無菌濾紙,分別吸取150微升種子懸浮液(約150粒)均勻的散布在兩張濾紙條上。在培養(yǎng)基中心接種約O. 5cm3 (IcmX lcmXO. 5cm)含有不同來源的單一共生真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理組，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng)培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為2000Lx-3000Lx，溫度25°C ±2°C，光周期12h/12h L/Dο培養(yǎng)5周后，只有接種FDaI7菌株處理的種子萌發(fā)達(dá)到階段2及后續(xù)階段，達(dá)到階段2及后續(xù)階段的種子比率為48. 79%,而接種FCb4菌株、FDaI2菌株及未接菌對(duì)照組只有吸水膨脹達(dá)到階段I的種子，未形成原球莖，說明FDaI7為兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真
菌。 對(duì)所獲得的FDaI 7菌株進(jìn)行分子鑒定和比對(duì)，其為膠膜菌屬(Tulasenlla)真菌，且與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登錄號(hào)為⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最為相似,最大相似度達(dá)到99%。對(duì)此菌株采用試管斜面法保存于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園。
權(quán)利要求
1.一種獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，包括以下步驟 (1)在兜唇石斛花期進(jìn)行人工異交授粉，果實(shí)成熟但果莢尚未裂開時(shí)收獲果實(shí)，將種子干燥后置于無菌的密閉玻璃容器中在-20°C條件下保存，待用； (2)用滅菌的鑷子將100 200粒兜唇石斛的種子播種在尼龍網(wǎng)布上，將播好種子的尼龍網(wǎng)布對(duì)折，用熱封機(jī)將三邊封起來，制作完成種子袋，在種子袋邊緣縫上標(biāo)簽，便于監(jiān)測(cè)和回收； (3)選擇有兜唇石斛成年植株自然生長(zhǎng)的不同地點(diǎn)，將種子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹干上，在種子袋上面覆蓋一層苔蘚保濕； (4)每個(gè)月定期從各放置點(diǎn)回收2 3個(gè)種子袋，檢查種子袋內(nèi)種子的萌發(fā)情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有原球莖時(shí)，回收所有的種子袋； (5)將回收的原球莖依次用自來水沖洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗后切成兩半，切口面貼于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA上進(jìn)行培養(yǎng)； (6)原球莖切口處長(zhǎng)出菌絲時(shí)，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移3 5次后，得到純菌落； (7)將兜唇石斛的種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液，在配制好的燕麥瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養(yǎng)基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理組，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng)； (8)每周觀察I次不同處理的種子，記錄種子萌發(fā)數(shù)量及萌發(fā)時(shí)間，對(duì)種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進(jìn)行分級(jí)，記錄每一階段內(nèi)種子或原球莖的數(shù)量，通過和不接菌處理組的對(duì)比，篩選出兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于所述的所述的種子袋采用網(wǎng)孔為45 μ m的尼龍網(wǎng)布。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于步驟(3)中，種子袋放置時(shí)應(yīng)盡量靠近成年植株根部，并使種子袋呈水平狀態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于步驟(3)中所述的種子袋放置點(diǎn)為同時(shí)有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗處。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于步驟(5)所述的次氯酸鈉溶液有效氯離子濃度為I %，消毒3 5分鐘，無菌水沖洗3 4次。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于步驟(7)所述的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為2000Lx-3000Lx，溫度25°C ±2°C，光周期12h/12hL/D。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌的方法。將兜唇石斛母株通過人工異交授粉后得到成熟的種子，把種子放入特制的種子袋中，將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長(zhǎng)的原生地，在自然條件下誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖；將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)原球莖中的內(nèi)生真菌生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出菌絲時(shí)，進(jìn)行真菌的純化，獲得純菌落；將獲得的真菌和兜唇石斛的種子進(jìn)行共生萌發(fā)培養(yǎng)，設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)所獲得的真菌對(duì)兜唇石斛的種子萌發(fā)的有效性，篩選出兜唇石斛種子萌發(fā)的有效共生真菌，并進(jìn)行真菌的分子鑒定和保存。本發(fā)明為利用兜唇石斛種子和真菌共生萌發(fā)來培育種苗開辟了一條新的途徑。
文檔編號(hào)A01C1/04GK102612966SQ20121009750
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者林華, 盛春玲, 范旭麗, 高江云 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園