專利名稱：一種同源四倍體水稻的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種多倍體水稻的誘導方法，特別涉及一種同源四倍體水稻的誘導方法，屬于遺傳育種技術領域。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物。雜交水稻的培育成功是水稻育種上的一項重大突破，對解決我國和世界糧食問題做出了巨大的貢獻。但隨著經濟的發展，人口增加，土地面積減少以及環境的惡化，使糧食問題顯得十分突出。另據聯合國糧農組織分析預測，到2025年世界人口將達到85億人，糧食缺口將達到8億噸。因此，要徹底解決全球糧食危機，特別是中國等發展中國家的糧食問題，雜交水稻的產量還遠遠不夠，還必須培育出產量更高的優質新品種或新組合。
自然界廣泛存在植物多倍體現象，多倍體具有繁茂性、碩大性、適應力強、生物產量高等優點，一直是育種家長期追求的目標。關于水稻染色體組多倍化所導致的優勢現象的研究目前仍然處于探索性階段，其潛在的研究意義和利用價值近年來已經引起了一些研究者的關注。在同源四倍體水稻的育種研究中，傳統技術主要包括物理法(冷熱刺激)、化學法(化學物質誘導)和生物法(自然變異)。其中，利用秋水仙素對種芽進行誘導的方法(種芽誘導法)是獲得同源四倍體水稻種質比較好的傳統方法。然而，在過去六十多年的研究中，同源四倍體水稻研究的技術性難題之一仍然是染色體組多倍化的誘導頻率太低(通常低于萬分之一)，以至于同源四倍體水稻的種質資源相當有限(目前全世界的同源四倍體水稻的種質資源少于3000份，而二倍體水稻的種質資源已經超過200000份)。同源四倍體水稻的誘導頻率太低的主要原因應該歸咎于傳統的種芽誘導技術和稻谷種胚的形態結構。利用種芽誘導法獲得同源四倍體水稻的頻率低的原因主要歸結于以下三方面其一，從種芽誘導法的技術路線來看，當利用秋水仙素水溶液對稻谷的種芽進行處理時，種芽的生長點外圍還包裹著其它的組織(如胚芽鞘、不完全葉、第一片真葉、第二片真葉等等)，這對于秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點并對其細胞產生染色體組多倍化的誘導作用會有很大的限制(即秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點細胞位置的難度加大)。其二，在種芽內的生長點細胞的結構比較復雜，其中包括外圍的兩層形成層細胞和由其包圍的一群形態不規則的分生細胞。當秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點細胞區域時，由于各個細胞的發育進度不一致，由此導致某些分生細胞被誘導為多倍體細胞而另一些分生細胞并沒有被誘導為多倍體細胞。其三，在種芽內具有不同染色體組倍性的生長點細胞的發育進度不一致，即二倍體分生細胞在生長發育上比多倍體分生細胞更有優勢，結果使二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞限制了多倍體分生細胞及其子細胞的生長發育速度，最后只能由大部分二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞完成植株的形態建成，在誘導當代植株的稻穗中出現膨大穎花的機率很低(從種芽開始生長發育到幼穗分化，再到孕穗始穗這一段生長發育期，二倍體分生細胞比多倍體分生細胞具有更強的生長勢)。由于以上三方面原因，導致利用傳統的種芽誘導法獲得同源四倍體水稻的頻率通常很低(誘導頻率低于0.01% )，因此通過研究尋找一種提高同源四倍體水稻的誘導頻率的方法，顯得尤為重要。

發明內容
鑒于現有技術中同源四倍體水稻誘導頻率太低的問題，本發明采用種芽誘導和無性系技術相結合，由此建立一種多倍體水稻的誘導方法，尤其提供一種同源四倍體水稻的誘導方法。該方法可以顯著提高同源四倍體水稻的誘導頻率，以便在最短的時間內創制出更多的同源四倍體水稻新種質，由此促進水稻染色體組多倍化的研究進程。本發明的目的是這樣實現的
在本發明所提出的誘導同源四倍體水稻的方法中，采用二倍體水稻種子作為外植體，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導愈傷組織；d.再生苗誘導并獲得實生苗。所述浸種催芽的過程為以二倍體水稻種子為材料，在30°C條件下浸泡48小時，每12小時清洗I次，清洗后將種子放在濕紙上催芽，直至種子露出白色芽點為止。所述秋水仙素水溶液處理的過程為將露出白色芽點的種子浸泡在0. 1%的秋水仙素水溶液中48小時，每隔12小時清洗I次，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時。所述無性系誘導愈傷組織的過程為將經過消毒的帶有膨大芽的水稻種子接種在N6培養基上，在溫度為30°C的黑暗條件下培養30 35天，由此誘導出愈傷組織。所述再生苗誘導并獲得實生苗的過程為將帶有愈傷組織的培養瓶移至光照培養室，在N6培養基上再培養60 80天，待再生苗長至10 15cm時進行實生苗煉苗處理。在試驗中分別以IR28、IR36和新稻10號種子為外植體進行同源四倍體水稻的誘導，均獲得了比較好的試驗效果和一大批同源四倍體水稻新種質。與現有技術相比，本發明涉及的同源四倍體水稻誘導方法具有如下優點和顯著的技術進步(I)在傳統的種芽誘導法中，秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點細胞位置的難度比較大，而在本發明所提出的方法中首先利用秋水仙素水溶液直接處理種芽細胞，進而使種芽細胞很容易接觸到秋水仙素水溶液，這有助于秋水仙素對種芽細胞的誘導。(2)在傳統的種芽誘導法中，種芽內的生長點細胞的結構比較復雜，由此導致某些分生細胞有可能被誘導為多倍體細胞，而另一些分生細胞并沒有可能被誘導為多倍體細胞。在本發明所提出的方法中所有與秋水仙素水溶液直接接觸的種芽細胞都有可能被誘導為多倍體或非整倍體，進而使得無性系接種材料中多倍體或非整倍體細胞的比例大大增力口，而二倍性細胞的比例相對減少，這有助于增加具有染色體組多倍性的愈傷組織。(3)在傳統的種芽誘導法中，種芽內具有不同染色體組倍性的生長點細胞的發育進度不一致，二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞限制了多倍體分生細胞及其子細胞的生長發育速度，最后只能由大部分二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞完成植株的形態建成。在本發明所提出的方法中，所有被秋水仙素水溶液誘導的種芽細胞在培養基上均具有被誘導為愈傷組織的可能性，一旦被脫分化為無性系則有可能分化為實生苗，這有助于提高多倍體實生苗的誘導頻率。由于以上三方面的技術改進和技術優點，進而導致利用本發明的誘導法獲得同源四倍體水稻的頻率通常比較高(誘導頻率高于3. 0% )。


圖為同源四倍體水稻無性系誘導法的技術路線圖。
具體實施例方式以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例I以二倍體粳稻品種“新稻10號”為材料所進行的同源四倍體誘導試驗，技術路線如圖I所示。在這一技術體系中，首先將“新稻10號”種子置于燒杯中在30°C條件下用無菌水浸種48小時，每隔12小時用無菌水清洗I次。清洗后將種子放在濕紙上催芽48小時左右，直至種子露出白色芽點為止。隨后，利用0. I %的秋水仙素水溶液對試驗材料的萌動種芽進行浸泡48小時(浸泡24小時后清洗I次并加入新鮮的秋水仙素水溶液)，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時，由此對種芽細胞進行染色體組多倍化誘導。接著，以彭大的種芽為試驗材料將其接種在N6培養基上，在溫度為30°C的黑暗條件下培養30 35天。由此在無性系條件下誘導出愈傷組織(即脫分化處理)。在這樣的愈傷組織內包括二倍體細胞和多倍體細胞以及非整倍體細胞，它們在無性系條件下被再分化為實生苗的機率在理論上幾乎相等。然后，經過繼代接種后在N6培養基上促使愈傷組織再分化出實生苗，即將帶有愈傷組織的培養瓶移至光照培養室，在N6培養基上再培養60 80天，待再生苗長至10 15cm時進行實生苗煉苗處理。在這些實生苗中包括二倍體和多倍體(同源三倍體和同源四倍體)以及非整倍體等，同源四倍體出現的頻率大大提高。經過煉苗后將實生苗移植到田間栽種，并根據同源四倍體水稻的形態特征(植株粗壯、大穎殼、穎殼頂端長芒和結實率低等)對其進行鑒定篩選。結果是同源四倍體水稻誘導頻率高于3.0%。本發明所述的N6培養基，其配方如下1.無機物單位mg/L 硝酸鉀2800
硫酸銨463
磷酸二氫鉀400
硫酸鎂(MgS04 7H20)185
氯化鈣(CaC12 2H20)165
乙二胺四乙酸二鈉37.3 硫酸亞鐵(FeS04 7H20)27.8
硫酸錳(MnS04 H20)4.4
硫酸鋅(ZnS04 7H20)1.5
硼酸1.6
碘化鉀0.8
2.有機物單位mg/L 維生素BI(鹽酸硫胺素)1.0 維生素B6(鹽酸吡哆醇)O.5 煙酸0.5 甘氨酸2.0 蔗糖20000
pH 值 5.8250C
用法稱取本品24. lg，加熱攪拌溶解于IOOOml蒸餾水中，分裝三角瓶115°C高壓滅菌20分鐘備用。
權利要求
1.一種同源四倍體水稻的誘導方法，采用二倍體水稻種子作為外植體，其特征在于，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導愈傷組織；d.再生苗誘導并獲得實生苗。
2.根據權利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導方法，其特征在于，所述浸種催芽的過程為以二倍體水稻種子為材料，在30°C條件下浸泡48小時，每12小時清洗I次，清洗后將種子放在濕紙上催芽，直至種子露出白色芽點為止。
3.根據權利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導方法，其特征在于，所述秋水仙素水溶液處理的過程為將露出白色芽點的種子浸泡在0. 1%的秋水仙素水溶液中48小時,每隔12小時清洗I次，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時。
4.根據權利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導方法，其特征在于，所述無性系誘導愈傷組織的過程為將經過消毒的帶有膨大芽的水稻種子接種在N6培養基上，在溫度為 30°C的黑暗條件下培養30 35天，由此誘導出愈傷組織。
5.根據權利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導方法，其特征在于，所述再生苗誘導并獲得實生苗的過程為將帶有愈傷組織的培養瓶移至光照培養室，在N6培養基上再培養60 80天，待再生苗長至10 15cm時進行實生苗煉苗處理。
6.根據權利要求1-5任一項所述的同源四倍體水稻的誘導方法，其特征在于，所述二倍體水稻種子為IR28、IR36或新稻10號種子。
全文摘要
本發明公開了一種同源四倍體水稻的誘導方法，該方法采用二倍體水稻種子作為外植體，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導愈傷組織；d.再生苗誘導并獲得實生苗。本發明方法可以顯著提高同源四倍體水稻的誘導頻率，以便在最短的時間內創制出更多的同源四倍體水稻新種質，由此促進水稻染色體組多倍化的研究進程。
文檔編號A01H1/08GK102726289SQ20121019135
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者張世萍, 黃群策 申請人:張世萍, 黃群策