專利名稱：煙堿生物合成pmt1基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因工程技術領域，具體涉及ー種煙堿生物合成PMTl基因啟動子及其應用。
背景技術：
煙堿(Nicotin)，又稱尼古丁，化學名稱為I-甲基_2-(2_吡啶基)吡咯烷，分子式為CltlH4N2，是ー種天然存在于煙草中的生物堿，是煙草中特有的。煙堿能夠對人產生一定的生理刺激作用，是使煙草具有商品價值的主要因素。隨著煙堿的生物活性越來越受到人們的重視，其應用也越來越廣泛，對它們的開發已經逐漸深入到食品、保健、醫藥和日用用化工等多個領域，應用前景非常廣闊。如煙草替代品生產需要大量的煙堿目前對煙草依賴的治療方法包括藥物治療、心理治療、針灸和中藥治療等，經美國FDA批準的治療方案和藥物主要有煙堿替代療法如煙堿貼劑、ロ膠、鼻噴霧劑和吸入劑等，采用nAChR抑制劑藥物治療，如安非他酮和注射劑如酒石酸瓦倫尼克林，還有美卡拉、去甲替林、可樂定和抗焦慮·藥等，這些煙堿替代物的生產需要大量提取煙堿作為原料；另外，煙堿還廣泛應用于環保農藥的開發以及特種疾患藥物的生產煙堿系列農藥屬植物殺蟲劑，因其具有蒸薰、胃毒、觸殺功能及迅速降解無殘留等特點廣泛用于糧食、油料、蔬菜、水果、牧草等農作物的殺蟲劑，是生產緑色食品的理想的高效殺蟲劑和生物性農藥，它還廣泛應用在醫藥エ業上，是研制治療心血管、皮膚病、蛇毒等疾患藥物的特種原料。還可用其所制得的檸檬酸煙堿應用于高級香煙的品種改良劑組分等，而且隨著煙草エ業、精細化工、制藥、有機合成、國防、農藥等的迅速發展。市場對煙堿的需求與日俱增，特別是高純煙堿的需求更大。煙堿分子包含一個吡咯烷環和吡啶環，而吡啶環是由NAD途徑合成的，吡咯烷環是由基本氨基酸經過中間產物腐胺形成的。參與煙堿生物合成的蛋白包括鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC),喹啉酸合成酶(quinolinatesynthase, QS),天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase, AO),喹啉酸磷酸核糖基轉移酶(quinolinate phospho-ribosyltransferase, QPT),腐胺 N-甲基轉移酶(putrescineN-methytransferase, PMT) (Katoh et al. , 2005; Cane et al. , 2OO5), ニ胺氧化酶(diamine oxidase,DAO),編碼這些蛋白的基因都可以在Λ 51ァJVe1Siri1S中找到。其中腐胺N-甲基轉移酶由三個基因編碼(PMTI，ΡΜΤ2, ΡΜΤ3) (Shoji et al. , 2000)。如果要通過編碼這些酶類的基因來調控煙堿的合成，則首先應當找到其對應的啟動子。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供ー種可對煙堿生物合成起調控作用的PMTl基因啟動子及其嵌合基因。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是
一種煙堿生物合成PMTl基因啟動子，其核苷酸序列為
(I) SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或(2)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列經重復、缺失、替換或移位等常規技術手段改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。擴增上述PMTl基因啟動子的引物對，具有SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。—種嵌合基因，其中包含上述煙堿生物合成PMTl基因啟動子以及與之可操作連接的、編碼目的基因的序列。ー種植物轉化載體，其中包含上所述嵌合基因。ー種轉基因植物細胞，其中包含上述嵌合基因。ー種轉基因植物組織，其中包含上述嵌合 基因。上述煙堿生物合成PMTl基因啟動子或上述嵌合基因在調控煙堿生物合成中的應用。本發明具有積極有益的效果
1.找到并提取出了煙堿生物合成PMTl基因啟動子；
2.煙堿PMTl基因啟動子區域產生基礎水平的轉錄，調控區域能夠對不同的環境條件作出應答，對煙堿合成基因的表達水平做出相應的調節(根據需要進行上調或下調)，進而對煙草種植生產出適量煙堿含量的煙葉以及生產出高品質的煙堿提取原料有著重要的現實意義。


圖I為PCR擴增煙堿基因啟動子電泳圖，其中左圖以N. tabacum基因組DNA為模板，右圖以N. sylvestris基因組DNA為模板；
圖2為PMT1，QPT, AO, QS等基因啟動子中含有的保守的轉錄結合位點框架圖；通過使用Genomatix公司的FrameWorker軟件分析單個的轉錄結合位點構建的框架圖；轉錄結合位點的的組織(包括DNA鏈的特異性，相對順序)都是保守的；不同基因啟動子中轉錄結合位點的距離變化非常小；不同顔色代表不同轉錄因子的結合位點；單線上面的符合代表轉錄結合位點位于有義鏈，而單線下面的符合代表轉錄結合位點位于反義鏈；
圖3為PMT1，QPT,A0, QS等基因啟動子中發現的轉錄因子示意模式圖；該模式圖由Genomatix公司的Fast軟件分析得到；模式圖中變化距離反應了三個基因啟動子序列中不同的轉錄因子結合位點之間的距離。
具體實施例方式以下結合具體實施例進ー步闡述本發明。下述實施例中所涉及的試驗方法或分析方法，如無特別說明，均為常規方法，所用試劑如無特別說明，均為市售。實施例I煙堿合成基因的分離、鑒定
煙堿合成基因PMT1, PMT2和PMT3，0DC，DA0，A0, QS, QPT啟動子序列均從Λsylvestris基因組序列中提取得到，這些基因在基因組中的位置如下表I所示。其中煙堿合成基因PMTl啟動子序列的如SEQ ID NO. I所示。表I各啟動子在Λ基因組中的位置
權利要求
1.一種煙堿生物合成PMTl基因啟動子，其核苷酸序列為 (1)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 (2)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列經重復、缺失、替換或移位改造修飾而成的具有同等功能的核苷酸序列。
2.擴增權利要求I所述PMTl基因啟動子的引物對，其特征在于，具有SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.一種嵌合基因，其中包含權利要求I所述煙堿生物合成PMTl基因啟動子以及與之可操作連接的、編碼目的基因的序列。
4.ー種植物轉化載體，其中包含權利要求3所述的嵌合基因。
5.ー種轉基因植物細胞，其中包含權利要求3所述的嵌合基因。
6.ー種轉基因植物組織，其中包含權利要求3所述的嵌合基因。
7.權利要求I所述煙堿生物合成PMTl基因啟動子或權利要求3所述嵌合基因在調控煙堿生物合成中的應用。
全文摘要
本發明涉及煙堿生物合成PMT1基因啟動子及其應用。該煙堿生物合成PMT1基因啟動子從N.sylvestris基因組序列中提取得到，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。煙堿PMT1基因啟動子區域產生基礎水平的轉錄，調控區域能夠對不同的環境條件作出應答，對煙堿合成基因的表達水平做出相應的調節(根據需要進行上調或下調)，進而對生產出高品質的煙堿提取原料有著重要的現實意義。
文檔編號A01H5/00GK102851288SQ20121022140
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月30日 優先權日2012年6月30日
發明者張松濤, 楊永鋒, 崔紅, 劉國順, 楊惠娟, 王景 申請人:河南農業大學