可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法。一種可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，包含以下步驟：(A)將牛樟菌接種至漂浮培養(yǎng)基的步驟；(B)進(jìn)行初期避光培養(yǎng)的步驟，促使牛樟菌增生聚集成漂浮于液面的牛樟菌菌塊；(C)在避光且密閉的休眠溫度環(huán)境下進(jìn)行休眠的步驟；(D)在避光的供氧環(huán)境下誘使牛樟菌菌塊的重新生長的步驟；及(E)重復(fù)循環(huán)該步驟(C)與該步驟(D)預(yù)定次數(shù)。通過上述漂浮培養(yǎng)方法設(shè)計(jì)，可使牛樟菌快速長出層疊狀類子實(shí)體形態(tài)的牛樟菌菌塊，且牛樟菌菌塊的三萜類含量高于一般固態(tài)培養(yǎng)方式，并適用于人工大量培養(yǎng)。
【專利說明】可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種真菌培養(yǎng)方法，特別涉及一種牛樟菌培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于牛樟芝所含有的三萜類成分已被證實(shí)對(duì)于人體免疫力的提升與許多癌癥的治療都具有療效，因此，有許多生技廠商開始投注大量研究資源開發(fā)牛樟芝相關(guān)醫(yī)藥品或保健品。
[0003]但是因?yàn)橐吧Ｕ林プ訉?shí)體取得不易，且價(jià)格昂貴，再加上野生牛樟芝子實(shí)體的三萜類不易萃取釋出，其萃取成本高。為取得大量牛樟芝三萜類成分，業(yè)者逐漸朝向?qū)嶒?yàn)室培養(yǎng)方面進(jìn)行研究，希望通過實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)的方式，來大量培養(yǎng)生產(chǎn)牛樟菌，以萃取其三萜類成分。
[0004]目前的主要培養(yǎng)方式大多是米用固態(tài)培養(yǎng)方式，目的在于大量培養(yǎng)出牛樟菌菌絲體，然后再由這些菌絲體萃取出所需的三萜類成分，但是在進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，牛樟菌菌絲在分散生長布滿固態(tài)培養(yǎng)基表面后，其生長速度就會(huì)開始減慢。且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，由牛樟菌菌絲體萃取出的三萜類成分含量，遠(yuǎn)不及牛樟芝子實(shí)體萃取出的三萜類含量，因此，如何提高人工培養(yǎng)的牛樟菌三萜類含量，是目前牛樟菌相關(guān)產(chǎn)業(yè)正積極研究的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種可提高人工培養(yǎng)的牛樟菌的三萜類含量的牛樟菌培 養(yǎng)法。
[0006]本發(fā)明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，依序包含以下步驟:(A)將含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體接種至漂浮培養(yǎng)基的步驟，所述漂浮培養(yǎng)基包括含有牛樟木萃取液的營養(yǎng)液，及沉浸于該營養(yǎng)液中的固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊，該培養(yǎng)載體局部浸泡在營養(yǎng)液中，且部分牛樟菌活性菌絲外露于營養(yǎng)液液面上方，而部分牛樟菌活性菌絲局部浸泡在營養(yǎng)液中；(B)在供氧且適合牛樟菌生長的培養(yǎng)環(huán)境溫度條件下進(jìn)行初期避光培養(yǎng)的步驟，促使外露于營養(yǎng)液液面上方的牛樟菌活性菌絲增生，而于該培養(yǎng)載體上聚集成局部外露于營養(yǎng)液液面上方的牛樟菌菌塊，且使該牛樟菌菌塊的部分活性菌絲增生附著于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊擷取養(yǎng)分；(C)在避光環(huán)境下進(jìn)行休眠的步驟，密封培養(yǎng)環(huán)境而停止供氧，并將培養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)降至休眠溫度，誘使牛樟菌進(jìn)入休眠期，并維持休眠期預(yù)定期間；(D)在避光環(huán)境下誘使牛樟菌重新生長的步驟，對(duì)該培養(yǎng)環(huán)境重新供氧，且將培養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)升至適合牛樟菌生長的溫度，誘使該牛樟菌菌塊位于液面上的孢子萌發(fā)生長成活性菌絲，并維持此生長期預(yù)定時(shí)間 '及(E)重復(fù)循環(huán)該步驟(C)與該步驟(D)預(yù)定次數(shù)。
[0007]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(A)的營養(yǎng)液液面會(huì)高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣，該培養(yǎng)載體局部沉浸在營養(yǎng)液中，而疊靠于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣。
[0008]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(A)的漂浮培養(yǎng)基的營養(yǎng)液液面高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣的距離范圍介于0.5-2cm之間。
[0009]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(A)中局部浸泡于營養(yǎng)液中的培養(yǎng)載體間隔位于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊旁側(cè)。
[0010]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(A)的漂浮培養(yǎng)基裝在培養(yǎng)容器中，該步驟(B)與該步驟(D)還會(huì)分別在牛樟菌的培養(yǎng)期期間，調(diào)控該培養(yǎng)容器所在的培養(yǎng)環(huán)境的濕度，使培養(yǎng)容器中的營養(yǎng)液保持局部浸泡該牛樟菌菌塊。
[0011]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(B)與該步驟(D)的培養(yǎng)環(huán)境溫度較佳范圍介于15-25°C之間。
[0012]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(C)的休眠溫度范圍介于4-10°C之間。
[0013]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(C)的休眠期時(shí)間為24小時(shí)以上。
[0014]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，該步驟(C)休眠期的較佳時(shí)間長度為72小時(shí)。
[0015]本發(fā)明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，所述漂浮培養(yǎng)基由提供碳源與氮源的五谷雜糧，及枸杞、土肉桂、提供胡蘿卜素與維生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液與二次蒸餾水混合并經(jīng)高溫滅菌處理制成。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:通過讓牛樟菌菌塊局部外露于營養(yǎng)液液面上，而局部菌絲附著于固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊，以及交替休眠與生長的漂浮培養(yǎng)方法設(shè)計(jì)，可誘使牛樟菌在短期間內(nèi)長出層疊狀類子實(shí)體產(chǎn)物的菌塊，且所培養(yǎng)出的牛樟菌菌塊的三萜類含量會(huì)明顯高于一般固態(tài)培養(yǎng)方式，并適用于人工大量培養(yǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法的較佳實(shí)施例的步驟流程圖；
[0018]圖2是該較佳實(shí)施例的步驟示意圖；
[0019]圖3是該較佳實(shí)施例培養(yǎng)所得牛樟菌(BCRC35396)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實(shí)體萃出物的HPLC圖譜比較；
[0020]圖4是一般固態(tài)培養(yǎng)的牛樟菌(B CRC 35396)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實(shí)體萃出物的HPLC圖譜比較:
[0021]圖5是該較佳實(shí)施例培養(yǎng)所得牛樟菌(BCRC37848)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實(shí)體萃出物的HPLC圖譜比較；
[0022]圖6是一般固態(tài)培養(yǎng)的牛樟菌(BCRC 37848)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實(shí)體萃出物的HPLC圖譜比較。
[0023]圖7是本發(fā)明采用的漂浮培養(yǎng)基裝于培養(yǎng)容器中的影像；
[0024]圖8是將含有牛樟菌的培養(yǎng)載體切片接種至該漂浮培養(yǎng)基后的影像；
[0025]圖9是本發(fā)明培養(yǎng)產(chǎn)生的牛樟菌菌塊的影像。
【具體實(shí)施方式】[0026]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明:
[0027]本發(fā)明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法的較佳實(shí)施例，是利用牛樟菌的生長具有厭水性的特性，特別將牛樟菌接種漂浮于培養(yǎng)液上，用于限制牛樟菌的生長方向，并通過模仿野生牛樟芝生長方式進(jìn)行牛樟菌的培養(yǎng)，以得到類似牛樟芝子實(shí)體的層疊狀類子實(shí)體產(chǎn)物，且該層疊狀類子實(shí)體產(chǎn)物可萃取出大量的三萜類成分。
[0028]如圖1、2所示，本發(fā)明漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法包含以下步驟:
[0029](一 )將牛樟菌活性菌絲接種至漂浮培養(yǎng)基400的步驟。
[0030]在本文中，術(shù)語“牛樟菌(Antrodia camphorata) ”意欲涵蓋那些為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)人士可易于獲得的牛樟菌菌株(例如，可購自于國內(nèi)或國外寄存機(jī)構(gòu)者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的新穎牛樟菌菌株。
[0031]在本實(shí)施例中，所采用的牛樟菌菌株是購自臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，寄存編號(hào)分別為BCRC35396及BCRC37848，菌株是預(yù)先進(jìn)行平板培養(yǎng)，而培養(yǎng)在培養(yǎng)載體300上，然后再將已培養(yǎng)出牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體300進(jìn)行切片，再將含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體切片301接種至漂浮培養(yǎng)基400。但是實(shí)施時(shí)，該培養(yǎng)載體300也可不需進(jìn)行切片，而直接將整個(gè)含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體300接種至漂浮培養(yǎng)基400。
[0032]在本實(shí)施例中，所采用的培養(yǎng)載體300為瓊脂(agar)成分的固態(tài)培養(yǎng)基，其制備方式如下:將葡萄糖20g、食品級(jí)酵母萃取物4g、V8蔬菜汁30ml與瓊脂(agar) 20g混合后，加入二次蒸懼水調(diào)整至1000ml,經(jīng)高溫滅菌爸(autoclave)在1.latm、12rC下進(jìn)行滅菌25分鐘，待其降溫后，平均倒入多個(gè)培養(yǎng)皿中冷卻凝固后，就獲得尚未接種牛樟菌的培養(yǎng)載體300。然后,將培養(yǎng)載體300移置37°C環(huán)境存放備用。實(shí)施時(shí)，由于牛樟菌平板培養(yǎng)可米用的培養(yǎng)載體300種類眾多，且只是一種中間載體，也非本發(fā)明的創(chuàng)作重點(diǎn)，因此培養(yǎng)載體300組分設(shè)計(jì)不以上述揭露的組分為限，實(shí)施時(shí)，也可直接以含有活性菌絲的牛樟芝子實(shí)體塊作為培養(yǎng)載體，同樣可進(jìn)行本發(fā)明漂浮培養(yǎng)。
[0033]該牛樟菌活性菌絲的預(yù)先平板培養(yǎng)方法如下:用接種針鉤取上述菌株的菌種保存管的少許菌絲，并分別穿刺接種于前述培養(yǎng)皿的培養(yǎng)載體300的中心部位。然后，將接種后的培養(yǎng)載體300移入17°C培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，直到培養(yǎng)所得的活性菌絲菌落500分布該培養(yǎng)載體300表面八分滿。
[0034]由于活性菌絲菌落500邊緣501的一小圈帶白色部分為高度生長區(qū)，且從該活性菌絲菌落500邊緣501往外延伸預(yù)定距離內(nèi)，通常都已含有肉眼看不清的前驅(qū)菌絲生長其中，也會(huì)有外泌酶分泌其中。因此，在從該培養(yǎng)載體300切取接種用的含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體切片301時(shí)，需取用包含這些含有前驅(qū)菌絲的部位，如此可使取得的含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體切片301移植接種于漂浮培養(yǎng)基400后，牛樟菌的生長不會(huì)出現(xiàn)明顯停滯現(xiàn)象。
[0035]在本實(shí)施例中，當(dāng)要切取培養(yǎng)載體切片301時(shí)，是從該培養(yǎng)載體300表面的活性菌絲菌落500邊緣501徑向往外延伸0.2cm處進(jìn)行環(huán)切后，再自該活性菌絲菌落500中心部位往外輻射分切成多片培養(yǎng)載體切片301，也就是說，每一等分培養(yǎng)載體切片301都含有牛樟菌的前驅(qū)菌絲。
[0036]配合參閱圖7，所述漂浮培養(yǎng)基400是裝在培養(yǎng)容器6中，包含有固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401，及包圍在該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401周圍的營養(yǎng)液402，且該營養(yǎng)液402液面高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣預(yù)定距離，也就是說，該營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401沉浸于該營養(yǎng)液402中，此設(shè)計(jì)關(guān)系著牛樟菌接種后是否可順利進(jìn)行本發(fā)明的漂浮培養(yǎng)生長，容后一并說明。
[0037]該漂浮培養(yǎng)基400含有牛樟菌生長所需的養(yǎng)分，在本實(shí)施例中，該漂浮培養(yǎng)基400包含用于提供碳源、氮源與礦物質(zhì)的五谷雜糧與蔬菜汁，及用于提供適合牛樟菌生長與構(gòu)成三萜類物質(zhì)的中間代謝物與萜類脂質(zhì)的土肉桂粉、干枸杞和牛樟木萃取液。
[0038]其中，五谷雜糧包含谷類與豆類。谷類選自小米、高梁、燕麥、大麥、蕎麥、糙米、薏仁或所述的組合。所述豆類選自黃豆、大豆、綠豆、紅豆、黑豆、花豆或所述的組合。蔬菜汁采用市售V8蔬菜汁，用于提供促進(jìn)牛樟菌生長的維生素與用于構(gòu)成三萜類的胡蘿卜素，其中，胡蘿卜素為四萜類，被代謝后會(huì)有較多制造三萜類起始合成結(jié)構(gòu)原料。由于可提供維生素與胡蘿卜素的蔬菜汁來源相當(dāng)多，因此實(shí)施時(shí)，蔬菜汁的選用不以市售V8蔬菜汁為限。
[0039]該牛樟木萃取液是將二次蒸餾水與牛樟木混合后，經(jīng)高溫滅菌釜在1.latm, 121°C下進(jìn)行滅菌I小時(shí)，接著快速泄壓而使得高溫滅菌釜中的水氣大量蒸發(fā)，而殘余的液體就是牛樟木萃取液。在本實(shí)施例中，使用的牛樟木包括木塊與未殺青枝葉，并將500g牛樟木加入IOL 二次蒸懼水后,依據(jù)上述方式來進(jìn)行萃取,而得到體積范圍為9-9.5L的牛樟木萃取液。
[0040]漂浮培養(yǎng)基400的制備方式是將上述成分與預(yù)定量的二次蒸餾水加入該培養(yǎng)容器6后，經(jīng)高溫滅菌釜在1.latm、121°C下進(jìn)行高溫殺菌處理I小時(shí)所制成。在高溫殺菌處理過程中，五谷雜糧、干枸杞、土肉桂粉等物質(zhì)會(huì)凝集成團(tuán)，而構(gòu)成前述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401，其余液體則構(gòu)成浸泡該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401周圍的營養(yǎng)液402。
[0041]在制備上述漂浮培養(yǎng)基400時(shí)，所添加的二次蒸餾水含量會(huì)隨采用的培養(yǎng)容器6大小與預(yù)定接種的 培養(yǎng)載體300或培養(yǎng)載體切片301大小而有所不同，目的在于使構(gòu)成的固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401完全浸泡在營養(yǎng)液402中，以及使接種后的培養(yǎng)載體300或培養(yǎng)載體切片301局部外露于營養(yǎng)液402液面上方。
[0042]在本實(shí)施例中，使用的培養(yǎng)容器6為500ml的螺旋蓋美乃滋瓶，漂浮培養(yǎng)基400成分含量為:五谷雜糧的谷類與豆類分別為70g與2g、干枸杞5g、土肉桂粉lg、蔬菜汁10ml、牛樟木萃取液10ml，及二次蒸餾水100ml，也就是總重IOlg的固形物混合120ml的液體，其中，五谷雜糧類的谷類包含燕麥15g、蕎麥15g、糙米25g與薏仁15g，而豆類為黃豆。但是實(shí)施時(shí)，上述成分含量只為較佳示范例，實(shí)施時(shí)應(yīng)當(dāng)不以此為限。且實(shí)施時(shí)，上述漂浮培養(yǎng)基400的營養(yǎng)液402與固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401也可分別制作后，再一起置入適當(dāng)尺寸的培養(yǎng)容器6中，不以一起制作為必要。
[0043]配合參閱圖8，將含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體切片301接種至漂浮培養(yǎng)基400時(shí)，將該培養(yǎng)載體切片301含有前驅(qū)菌絲的一端朝上地置入培養(yǎng)容器6中，使該培養(yǎng)載體切片301局部浸泡于營養(yǎng)液402,往下靠抵于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣，并使培養(yǎng)載體切片301含有前驅(qū)菌絲的部位外露于營養(yǎng)液402液面上。然后，將培養(yǎng)容器6的瓶蓋61旋緊后再倒懸開1/4圈，以維持透氣，就完成牛樟菌的漂浮培養(yǎng)的接種。
[0044]在進(jìn)行牛樟菌的漂浮培養(yǎng)的接種時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)容器6中營養(yǎng)液402液面高出固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣太多時(shí)，會(huì)致使置入培養(yǎng)容器6內(nèi)的培養(yǎng)載體切片301的大部分部位沉浸在營養(yǎng)液402中，也就是使大部分活性菌絲都浸泡在營養(yǎng)液402中，例如超過80%以上的活性菌絲浸泡在營養(yǎng)液402中時(shí)，會(huì)造成牛樟菌接種后就出現(xiàn)生長緩慢或立刻進(jìn)入休眠狀態(tài)的現(xiàn)象，而無法繼續(xù)執(zhí)行本發(fā)明的漂浮培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402太少，營養(yǎng)液402液面高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣的高度太低或低于固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣，會(huì)致使培養(yǎng)載體切片301置入培養(yǎng)容器6后，絕大部分活性菌絲會(huì)外露于液面上，例如超過80%以上的活性菌絲外露于液面上時(shí)，則在后續(xù)培養(yǎng)過程中，牛樟菌的生長就會(huì)與一般固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)相似，在生長布滿該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401表面后,就會(huì)休眠而出現(xiàn)生長停滯現(xiàn)象。
[0045]因此，該培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402液面高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣的距離，要根據(jù)采用的培養(yǎng)載體切片301的體積大小進(jìn)行調(diào)整，例如根據(jù)培養(yǎng)載體切片301的厚度進(jìn)行調(diào)整。就本實(shí)施例而言，由于該培養(yǎng)載體300為一般實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用，且裝于培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基，其厚度范圍介于0.5-1.5cm之間，所以營養(yǎng)液402液面高出固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣的較佳距離范圍介于0.5-2.5cm之間。
[0046]但是實(shí)施時(shí)，若是以牛樟芝子實(shí)體塊作為培養(yǎng)載體植入培養(yǎng)容器6內(nèi)的漂浮培養(yǎng)基400時(shí)，營養(yǎng)液402液面高出固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣的較佳距離范圍則不以
0.5-2.5cm為限，需根據(jù)該牛樟芝子實(shí)體塊大小與形狀，調(diào)整營養(yǎng)液402液面高度，以使預(yù)定比例的牛樟菌活性菌絲外露于液面上。其中，該培養(yǎng)載體300或培養(yǎng)載體切片301上的活性菌絲外露于營養(yǎng)液402液面上的比例范圍為20-80%，較佳范圍為40-60%，最佳為50%。
[0047]接著，(二 )在適合生長的環(huán)境條件下進(jìn)行初期培養(yǎng)的步驟，此階段主要是要利用牛樟菌的厭水特性，迫使牛樟菌往上生長。
[0048]將牛樟菌接種于漂 浮培養(yǎng)基400后,在供氧且適合牛樟菌生長的培養(yǎng)環(huán)境溫度條件下進(jìn)行初期培養(yǎng)，先誘使牛樟菌在該培養(yǎng)載體切片301上大量增生活性菌絲，前述活性菌絲包括營養(yǎng)菌絲與氣生菌絲等，并使前述菌絲聚集構(gòu)成菌塊。本實(shí)施例是在17°C環(huán)境中進(jìn)行避光培養(yǎng)，初期培養(yǎng)的期程為15天，但是實(shí)施時(shí)，所述培養(yǎng)環(huán)境溫度的最佳范圍可介于15~25°C之間，牛樟菌生長狀況會(huì)因?yàn)椴捎玫呐囵B(yǎng)載體300、營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401與營養(yǎng)液402成分差異而不同，所以初期培養(yǎng)期程可根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)情況而調(diào)整，較佳的初期培養(yǎng)期程介于10~30天之間。
[0049]另外，在初期培養(yǎng)過程中，會(huì)同時(shí)調(diào)控整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境的濕度，在高濕度環(huán)境下進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，以控制培養(yǎng)容器6中的液體蒸散速度與生成速度，使該營養(yǎng)液402維持在高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401預(yù)定距離的狀態(tài)。在本實(shí)施例中，該培養(yǎng)容器6是體積為500ml的美乃滋瓶，而培養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)定在17°C，所以培養(yǎng)環(huán)境濕度調(diào)整在70 %，但是實(shí)施時(shí)，因所使用的培養(yǎng)容器6尺寸與形狀的不同，也就是培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402液面的表面積差異，以及培養(yǎng)環(huán)境溫度的差異，該培養(yǎng)環(huán)境濕度可做適度調(diào)整。
[0050]在此初期培養(yǎng)過程的前期，牛樟菌的營養(yǎng)菌絲會(huì)在該培養(yǎng)載體切片301上大量增生，且部分營養(yǎng)菌絲會(huì)往下延伸入營養(yǎng)液402中，而附著于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401，并分解該營養(yǎng)液402與該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401以攝取所需養(yǎng)分，但是營養(yǎng)菌絲并未與固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401緊密結(jié)合，兩者仍會(huì)相對(duì)移動(dòng)；此外，牛樟菌的氣生菌絲也會(huì)大量疊生于前述營養(yǎng)菌絲上，且會(huì)隨著營養(yǎng)菌絲的增生外擴(kuò)而逐漸覆蓋整個(gè)培養(yǎng)載體切片301表面，并制造細(xì)胞間質(zhì)填充于菌絲間，進(jìn)而使所有菌絲逐漸連結(jié)聚集成團(tuán)，而構(gòu)成塊狀的牛樟菌菌塊302，并呈鮮艷橘紅色，且部分具備生殖能力的氣生菌絲會(huì)開始產(chǎn)生孢子。[0051]此外，這些大量增生的氣生菌絲會(huì)產(chǎn)生大量水蒸氣，通過控制培養(yǎng)環(huán)境濕度的方式，除了可降低水蒸氣的散除外，還可使培養(yǎng)容器6中的水蒸氣再冷凝變成水，而沿培養(yǎng)容器6的瓶壁流下。在此期間，培養(yǎng)載體切片301會(huì)因?yàn)榕Ｕ辆姆纸馀c長期浸泡在營養(yǎng)液402中而逐漸縮小，所以該牛樟菌菌塊302會(huì)逐漸變成局部沉浸于營養(yǎng)液401中，并靠抵于該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂緣的近似漂浮生長狀況。
[0052]在初期培養(yǎng)的末期，該牛樟菌菌塊302體積會(huì)大量增加，且牛樟菌菌塊302會(huì)因表面積增加量趕不上體積增加量，而無法攝取足夠氧氣以供呼吸代謝，造成中間代謝物快速累積，再加上，該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401頂部會(huì)被優(yōu)先分解而局部降低高度，致使靠抵的牛樟菌菌塊302也對(duì)應(yīng)下沉，因?yàn)榕Ｕ辆纳L具有厭水性，所以此下沉現(xiàn)象會(huì)致使分布于牛樟菌菌塊302周緣的部分菌絲浸入營養(yǎng)液402中，所以牛樟菌菌塊302會(huì)在初期培養(yǎng)的末期開始出現(xiàn)代謝遲緩與生長遲滯的休眠征兆，氣生菌絲會(huì)自鮮艷橘紅色逐漸褪色變白，且牛樟菌菌塊302微量皺縮。
[0053]接著，(三)在避光環(huán)境下進(jìn)行休眠的步驟。在完成牛樟菌的初期培養(yǎng)后，將培養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)降至休眠溫度范圍，并鎖緊培養(yǎng)容器6的瓶蓋61而停止供氧，使培養(yǎng)容器6中的牛樟菌完全進(jìn)入休眠狀態(tài)，并維持此休眠期預(yù)定時(shí)間，使菌絲代謝停止并停止生長。
[0054]在本實(shí)施例中，該休眠溫度為5°C，休眠期為72小時(shí)，但是實(shí)施時(shí)，適合牛樟菌的較佳休眠溫度范圍介于riO°C之間，而休眠期長短可視需要調(diào)整，大于24小時(shí)，就可使菌絲的生長代謝完全停止，所以實(shí)施時(shí)，休眠期不以72小時(shí)為限。
[0055]然后，(四)在避光環(huán)境下誘使牛樟菌重新生長的步驟。在完成休眠期后，將培養(yǎng)容器6瓶蓋61旋開1/4圈而重新開始供氧，并將培養(yǎng)環(huán)境溫度重新調(diào)高至適合牛樟菌生長的溫度，而誘使牛樟菌重新進(jìn)入生長期，使得牛樟菌菌塊302外露于液面的表面部位的孢子開始大量萌發(fā)生長成菌絲，并維持此生長期預(yù)定期間。
[0056]在此期間，會(huì)有大量鮮艷橘紅色的營養(yǎng)菌絲與氣生菌絲增生，并重新層疊生長布滿于牛樟菌菌塊302原本外露于液面的部位表面,部分新生的營養(yǎng)菌絲會(huì)往外延伸入營養(yǎng)液402中，以及往下延伸至該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401攝取養(yǎng)分，部分新生的營養(yǎng)菌絲則會(huì)往下延伸侵入其下層牛樟菌菌塊302中，以攝取先前累積的中間代謝物，借此使牛樟菌菌塊302出現(xiàn)層疊狀生長狀態(tài)，且牛樟菌菌塊302體積也會(huì)再次逐漸外擴(kuò)增大與增高。
[0057]在此重新生長期期間，水氣會(huì)再次大量蒸發(fā)，所以也會(huì)同時(shí)調(diào)控培養(yǎng)環(huán)境濕度，同樣在高濕度環(huán)境下進(jìn)行重新生長，以控制培養(yǎng)容器6中的液體蒸發(fā)量與生成量，使該培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402維持在高出該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401預(yù)定距離的狀態(tài)。本實(shí)施例設(shè)定的濕度為70%，但是實(shí)施時(shí)，同樣可根據(jù)培養(yǎng)容器6大小、培養(yǎng)環(huán)境溫度…等因素，適度調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境濕度。
[0058]與前述初期培養(yǎng)狀況相同，在此重新生長期的末期，牛樟菌菌塊302會(huì)因?yàn)槠浔砻娣e增加量小于其體積增加量，造成氧氣的攝取量不足以供其生長代謝之用，且也會(huì)因?yàn)樵摴虘B(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401的高度降低，而再次局部下沉入該營養(yǎng)液402中，致使該牛樟菌菌塊302新生分布于其周緣的部分菌絲浸泡于營養(yǎng)液402中，而開始出現(xiàn)生長遲滯且開始變白的現(xiàn)象，牛樟菌會(huì)再次逐漸出現(xiàn)休眠征兆。
[0059]在本實(shí)施例中，根據(jù)培養(yǎng)容器6的尺寸大小，較佳的生長期范圍介于1(T20天之間，最佳生長期為15天，但是實(shí)施時(shí)，生長期長短可視牛樟菌生長情況以及采用的培養(yǎng)容器6大小而調(diào)整。基本上，本發(fā)明主要是要誘使牛樟菌仿效野生牛樟芝的層疊生長方式進(jìn)行生長，且因牛樟菌菌塊302的后層生長量會(huì)受限于其前一層外露于液面的表面積量,若生長期過短，牛樟菌菌塊302表面積增加量太少，會(huì)不利于后層的生長，也就是說，牛樟菌菌塊302的后層面積會(huì)越來越小，而影響產(chǎn)率；若生長期太長，則不易進(jìn)行批量化管控，以及統(tǒng)一進(jìn)行休眠與生長的調(diào)控。
[0060]配合參閱圖9，(五)重復(fù)循環(huán)上述休眠步驟與重新生長步驟預(yù)定次數(shù)的步驟。通過調(diào)控培養(yǎng)環(huán)境溫度，誘使牛樟菌反復(fù)進(jìn)行休眠與重新生長的方式，可使培養(yǎng)的牛樟菌菌塊302的生長形態(tài)如野生牛樟芝子實(shí) 體的層疊狀生長的情況，而產(chǎn)生層疊狀的類子實(shí)體產(chǎn)物。
[0061 ] 在本實(shí)施例中，依據(jù)目前使用的漂浮培養(yǎng)基400總量，以及使用的培養(yǎng)容器6容量大小，該休眠步驟與重新生長步驟重復(fù)進(jìn)行共計(jì)十五個(gè)循環(huán)，為期九個(gè)月。但是實(shí)施時(shí)，休眠步驟與重新生長步驟的循環(huán)次數(shù)可依據(jù)漂浮培養(yǎng)基400的使用量與消耗情況，并配合牛樟菌菌塊302生長情況做適度調(diào)整，盡量培養(yǎng)至該固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊401被消耗殆盡，以減少資源的浪費(fèi)，同時(shí)可提高收成效益。
[0062]由于牛樟菌具有厭水生長特性，本發(fā)明上述漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法就是利用此厭水特性，將牛樟菌漂浮接種在漂浮培養(yǎng)基400的培養(yǎng)液402中進(jìn)行培養(yǎng)，迫使牛樟菌只能往液面上方大量增生并聚集成菌塊狀，而無法再如一般固態(tài)培養(yǎng)的分散生長。然后，通過交替誘使牛樟菌休眠與重新生長，每次的休眠與重新生長都會(huì)使牛樟菌菌塊302在原本的塊狀結(jié)構(gòu)上再產(chǎn)生一層新的菌層結(jié)構(gòu)，且牛樟菌菌塊302上新生的菌層除了會(huì)通過營養(yǎng)菌絲自營養(yǎng)液402與固態(tài)基質(zhì)團(tuán)塊401攝取養(yǎng)分外，還會(huì)往下自其下方菌層結(jié)構(gòu)中攝取先前累積的中間代謝物，并進(jìn)一步分解代謝產(chǎn)生三萜類成分。因此，通過循環(huán)誘使牛樟菌菌塊302上的牛樟菌交替休眠與重新生長，就可產(chǎn)生富含三萜類成分且類似野生牛樟芝子實(shí)體的層疊狀類子實(shí)體產(chǎn)物。
[0063]另外，必須說明的是，為避免培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402蒸散量過大，以致于發(fā)生營養(yǎng)液402液面過低，而致使牛樟菌出現(xiàn)類似固態(tài)培養(yǎng)生長的情況，所以在上述培養(yǎng)過程中，若培養(yǎng)容器6中的營養(yǎng)液402液面過低時(shí)，會(huì)適時(shí)添加二次蒸餾水以調(diào)整液面高度，但是實(shí)施時(shí)，此并非為必要步驟。
[0064]完成前述培養(yǎng)步驟后，取出培養(yǎng)所得牛樟菌菌塊302以進(jìn)行三萜類成分含量的分析。為進(jìn)一步比較一般固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟菌的三萜類含量差異，本發(fā)明另外就上述牛樟菌菌株以固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，并自中藥店購得三年生野生牛樟芝子實(shí)體以作為三萜類成分含量比較對(duì)象。
[0065]【固態(tài)培養(yǎng)方式如下說明】:
[0066]所使用的固態(tài)培養(yǎng)基組成與上述漂浮培養(yǎng)基400大致相同，唯一的差別在于添加的二次蒸餾水的水量，固態(tài)培養(yǎng)基在高溫殺菌處理前的總液量為80ml，經(jīng)高溫滅菌處理后，五谷雜糧與枸杞會(huì)呈濕潤顆粒狀。然后，將含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體接種至置于培養(yǎng)容器中的固態(tài)培養(yǎng)基上，并在供氧且避光的15°C環(huán)境與20°C環(huán)境中各十五天交替循環(huán)，為期九個(gè)月，以進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)。在此生長期間，牛樟菌菌絲會(huì)生長在固態(tài)培養(yǎng)基顆粒上。
[0067]【三萜類成分分析比較】
[0068]本申請(qǐng)三萜類成分是委托嘉南藥理科技大學(xué)食品科技系-有機(jī)與保健食品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室代為分析。
[0069]本申請(qǐng)漂浮培養(yǎng)方法所得牛樟菌(BCRC35396、BCRC 37848)菌塊:取出漂浮培養(yǎng)所得的125g牛樟菌菌塊302，并將其移入-70°C環(huán)境凍存隔夜，然后進(jìn)行真空冷凍干燥處理，凍干后的菌塊重11.Sg，并研磨成粉末，研磨大小為120目，以HPLC進(jìn)行三萜類成分分析。HPLC分析條件如下:
[0070]三萜類萃取:取適量粉末加入95%乙醇，在室溫下攪拌萃取六小時(shí)以上，然后濾除不溶物，再以0.45 ii m過濾器過濾備用。
[0071 ] HPLC分析:采用C 18管柱(0D S)，UV偵測器波長245nm，流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B為acetonitrile(乙腈),以表1所示梯度流洗進(jìn)行HPLC三職類圖譜分析。
[0072]表1
【權(quán)利要求】
1.一種可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于:依序包含以下步驟:(A)將含有牛樟菌活性菌絲的培養(yǎng)載體接種至漂浮培養(yǎng)基的步驟，所述漂浮培養(yǎng)基包括含有牛樟木萃取液的營養(yǎng)液，及沉浸于所述營養(yǎng)液中的固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊，所述培養(yǎng)載體局部浸泡在營養(yǎng)液中，且部分牛樟菌活性菌絲外露于營養(yǎng)液液面上方，而部分牛樟菌活性菌絲局部浸泡在營養(yǎng)液中；(B)在供氧且適合牛樟菌生長的培養(yǎng)環(huán)境溫度條件下進(jìn)行初期避光培養(yǎng)的步驟，促使外露于營養(yǎng)液液面上方的牛樟菌活性菌絲增生，而在該培養(yǎng)載體上聚集成局部外露于營養(yǎng)液液面上方的牛樟菌菌塊，且使所述牛樟菌菌塊的部分活性菌絲增生附著于所述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊擷取養(yǎng)分；(C)在避光環(huán)境下進(jìn)行休眠的步驟，密封培養(yǎng)環(huán)境而停止供氧，并將培養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)降至休眠溫度，誘使牛樟菌進(jìn)入休眠期，并維持休眠期預(yù)定期間；(D)在避光環(huán)境下誘使牛樟菌重新生長的步驟，對(duì)所述培養(yǎng)環(huán)境重新供氧，且將培養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)升至適合牛樟菌生長的溫度，誘使所述牛樟菌菌塊位于液面上的孢子萌發(fā)生長成活性菌絲，并維持此生長期預(yù)定時(shí)間；及(E)重復(fù)循環(huán)所述步驟(C)與所述步驟(D)預(yù)定次數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(A)的營養(yǎng)液液面會(huì)高出所述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣，所述培養(yǎng)載體局部沉浸在營養(yǎng)液中，而疊靠于所述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(A)的漂浮培養(yǎng)基的營養(yǎng)液液面高出所述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊頂緣的距離范圍介于0.5_2cm 之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(A)中局部浸泡于營養(yǎng)液中的培養(yǎng)載體間隔位于所述固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)團(tuán)塊旁側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3 或4所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(B)與所述步驟(D)還會(huì)分別在牛樟菌的培養(yǎng)期期間，調(diào)控所述培養(yǎng)環(huán)境的濕度，使?fàn)I養(yǎng)液保持局部浸泡所述牛樟菌菌塊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(B)與所述步驟(D)的培養(yǎng)環(huán)境溫度較佳范圍介于15-25°C之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(C)的休眠溫度范圍介于4-10°C之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(C)的休眠期時(shí)間為24小時(shí)以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述步驟(C)休眠期的較佳時(shí)間長度為72小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養(yǎng)法，其特征在于，所述漂浮培養(yǎng)基是由提供碳源與氮源的五谷雜糧，及枸杞、土肉桂、提供胡蘿卜素與維生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液與二次蒸餾水混合并經(jīng)高溫滅菌處理制成。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK103518528SQ201210235696
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】劉宗翰 申請(qǐng)人:豐苗生物科技股份有限公司