專利名稱：一種簡便的腐霉菌快速分離培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種簡便、快速分離腐霉菌的選擇性培養基。屬于微生物技術領域。
背景技術：
腐霉菌是世界性分布的土壤真菌，腐生能力很強，可以侵染150多種蔬菜瓜果作物的根部和幼苗，引起爛種、猝倒、立枯、爛根和爛果。其中，由瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)引起的粹倒病是瓜菜、花丼、藥用植物、煙草和豆類、棉花、玉米、高粱等植物幼苗期一種世界范圍內的毀滅性病害。由通常在出苗后，莖基部近地面處產生水潰狀暗色斑，繼而繞莖擴展，逐漸縊縮呈細線狀，使幼苗地上部因失去支撐能力而折倒，俗稱卡脖子病。濕度大時病部或土表會產生白色棉絮狀物，即病菌菌絲、孢囊梗和孢子囊。在氣候適宜的條件下，短期內就可爆發，蔓延速度極快，嚴重情況下可導致植物幼苗大面積死亡，造成缺苗甚至毀種，給農業生產帶來嚴重的經濟損失。瓜果腐霉(P. aphanidermatum)屬于卵菌門霜霉目腐霉科腐霉屬。病菌以卵孢子在12-18cm表土層越冬，并在土中長期存活。猝倒病的初侵染源主要以瓜果腐霉的卵孢子和厚垣孢子在土壤、病殘體中越冬，其中土壤中的病殘體帶菌率最高。在適宜條件下可萌發產生孢子囊，以游動孢子或直接長出芽管侵染幼苗引起猝倒。田間的再侵染主要靠病苗上產出孢子囊及游動孢子，借灌溉水或雨水濺附到貼近地面的根莖上引致更嚴重的損失。該病主要在幼苗出土后、長出1-2片葉之前發生。尤其是育苗期出現低溫、高濕條件，利于發病。為了對瓜果腐霉進行相關研究，以及調查病原菌的田間發病情況，篩選高效的藥齊U，最終達到有效防治該病害的目的，分離獲得純化的瓜果腐霉是必要的前提條件。常規的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75%乙醇和0. I %升汞液表面消毒處理。實際工作中，從田間采集到的樣本除被瓜果腐霉侵染外，不可避免的常常帶有鐮刀菌，立枯絲核菌和疫霉等其他非目標真菌和細菌，按常規方法進行分離組織病原菌時，由于這些非目標真菌或細菌的污染，造成目標菌分離率低或難于分離到目標菌。因此，利用普通培養基從病組織上或土壤中分離瓜果腐霉時，達不到分離純化的目的。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種殺菌劑組合。本發明所提供的殺菌劑組合，其活性成分如下述I)、2)所示I)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉、利福平組成；2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉、利福平組成；上述殺菌劑中，所述I)中，所述多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質量份數比為(10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70或 50 : 50 : 10 100 ；
所述2)中，所述咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質量份數比為(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70或 20 : 50 : 10 100 ；本發明的另一個目的是提供一種用于分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培養基。本發明所提供的 用于分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培養基,為如下I或II所示I、是向PDA培養基中添加權利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的；II、是向PDA培養基中添加權利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的；上述培養基中，所述I所示培養基中，所述多菌靈在所述PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為 10 V- g/mL、20 u g/mL 或 50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養基中的濃度為g/mL-10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養基中的濃度為50 ii g/mL-IOOu g/mL，具體為50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培養基中，所述II所示培養基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL 20 V- g/mL,具體為 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養基中的濃度為5 V- g/mL-10 u g/mL,具體為5 u g/mL、7 u g/mL或10 ii g/mL ;所述利福平在所述PDA培養基中的濃度為50 u g/mL-100 u g/mL,具體為50 u g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培養基在分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明所提供的分離瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的方法,包括如下步驟用上述任一所述培養基進行分離，用于分離的樣本為感染瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的植物的根莖或土壤。實驗證明，本發明的PDA選擇性培養基具有可行性、準確性、實用快捷和成本低廉、制備簡便的特點。用本發明的PDA選擇性培養基分離瓜果腐霉，可解決瓜果腐霉等植物病原腐霉分離過程中各種非目標真菌和細菌污染嚴重的問題，且速度快，效率高，省時、省力。本發明為成功分離其他腐霉屬菌株提供了參考，為進行田間一次性分離以及室內純化瓜果腐霉提供技術支持。本發明選擇培養基可用于簡便、快捷地從病株組織上或病田土壤中一次性分離瓜果腐霉以及室內純化瓜果腐霉。


圖I為三種抗生素對植株根莖表面細菌的抑制作用。圖2為三種抗生素對土壤中細菌的抑制作用。圖3為瓜果腐霉病的發病情況和分離情況。A為健康的黃瓜幼苗；B為瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；C為田間瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；D為瓜果腐霉引起的草坪腐霉枯萎病；E為育苗階段瓜果腐霉引起的猝倒病；F為發病植株中分離到的瓜果腐霉。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。多菌靈原藥購自安徽廣信農化股份有限公司(安徽廣信農化集團有限公司)，其主要活性成分物質的化學名稱是N-(2_苯駢咪唑基)_氨基甲酸甲酯，通用名稱為多菌靈，分子式C9H9N302。該藥中主要活性成分物質的質量百分含量為98. 9%。五氯硝基苯原藥購自山西三立化工有限公司(原山西省臨汾有機化工廠)，其主要活性成分物質的化學名稱是五氯硝基苯，通用名稱為五氯硝基苯，分子式C6C15N02。該藥中五氯硝基苯的質量百分含量為95%。咪鮮胺(又叫“咪酰胺”)原藥購自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物質的化學名稱是N-丙基-N-[2-(2，4，6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。該藥中咪鮮胺的質量百分含量為97%。氟嗎啉原藥購自沈陽化工研究院，其主要活性成分物質的化學名稱是4-[3_(3，
4-二甲氧基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸]嗎啉，通用名稱為氟嗎啉，分子式C21H22FN04。該藥中主要活性成分物質的質量百分含量為96%。 青霉素、利福平、氯霉素均購自北京拓英坊科技有限公司。實施例I、三種真菌抑制劑、一種疫霉抑制劑和三種抗生素對瓜果腐霉抑制作用一、三種真菌抑制劑和一種疫霉抑制劑對瓜果腐霉的抑制作用以二甲基甲酰胺為多菌靈的溶劑，以丙酮或甲醇為咪鮮胺、五氯硝基苯和氟嗎啉的溶劑，分別配制5000ii g/mL的四種藥劑母液IOml ;其中，將多菌靈、五氯硝基苯和咪鮮胺這三種真菌抑制劑的母液分別配制系列濃度為50 u g/mL、20 u g/mL和10 u g/mL的含藥PDA平板；將氟嗎啉這種疫霉抑制劑的母液分別配制系列濃度為20 u g/mL、10 u g/mL和5 y g/mL的含藥PDA平板，以加有溶劑的平板為對照；然后采用菌絲生長速率法測定瓜果腐霉對菌靈、五氯硝基苯、咪鮮胺和氟嗎啉的敏感性。將供試的瓜果腐霉菌株在PDA平板上于25°C預培養2d，用直徑為5mm的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含有四種藥劑系列濃度的PDA含藥平板中央(各濃度含等量有機溶劑)，于25°C下黑暗培養，2-3d后用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5mm)，每處理重復3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率(％ )，抑制率(%) = [(對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑)/ (對照菌落增長直徑)]X 100。測定了供試的四種真菌抑制劑對瓜果腐霉的抑制作用，結果如表I所示，不同濃度的多菌靈、五氯硝基苯對瓜果腐霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50ii g/mL的多菌靈、五氯硝基苯作為選擇性藥劑；50ii g/mL咪鮮胺對瓜果腐霉的抑制率為27%，10-20 ii g/mL濃度的咪鮮胺對瓜果腐霉抑制率較低，所以可以采用10-20ii g/mL的咪鮮胺為分離腐霉中使用的選擇性藥劑。濃度為20 g/mL氟嗎啉對瓜果腐霉的抑制率大于
11.2%,IOu g/mL氟嗎啉對瓜果腐霉抑制率為4. 5%，2 ii g/mL的濃度對辣椒疫霉沒有抑制作用，因此，可以采用2-10 ii g/mL濃度的氟嗎啉作為選擇性藥劑；表I四種真囷抑制劑對瓜果腐霉的抑制作用
權利要求
1.一種殺菌劑，其活性成分如下述I)或2)所示 1)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成； 2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成。
2.根據權利要求I所述的殺菌劑，其特征在于 所述I)中，所述多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質量份數比為(10-20) (10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70 或50 50 10 100 ； 所述2)中，所述咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平的質量份數比為(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具體為 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70 :或 20 : 50 : 10 : 100。
3.一種用于分離瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的培養基,為如下I或II所示 I、是向PDA培養基中添加權利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的； II、是向PDA培養基中添加權利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。
4.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于 上述培養基中，所述I所示培養基中，所述多菌靈在所述PDA培養基中的濃度為IOii g/mL-50 V- g/mL,具體為10 u g/mL、20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養基中的濃度為IOii g/mL-50 V- g/mL,具體為IOy g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養基中的濃度為g/mL -10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養基中的濃度為50 u g/mL-100 u g/mL,具體為50 u g/mL、70 u g/mL或100u g/mL ； 上述培養基中，所述II所示培養基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL-20 V- g/mL,具體為 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培養基中的濃度為10 V- g/mL-50 V- g/mL,具體為10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟嗎啉在所述PDA培養基中的濃度為g/mL-10 u g/mL,具體為5 ii g/mL、7 ii g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培養基中的濃度為50 ii g/mL-IOOu g/mL，具體為50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL。
5.權利要求3或4所述培養基在分離瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)中的應用。
6.一種分離瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的方法，包括如下步驟用權利要求3或4中所述培養基進行分離，用于分離的樣本為感染瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)的植物的根莖部組織或土壤。
全文摘要
本發明公開了一種簡便、快速的分離腐霉菌的選擇性培養基，尤其適用于瓜果腐霉的分離。屬于微生物技術領域。該培養基是向PDA培養基中添加如下1)或2)所述殺菌劑得到的1)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成；2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成；實驗證明，本發明的PDA選擇性培養基具有可行性、準確性、實用快捷和成本低廉、制備簡便的特點。用本發明的PDA選擇性培養基分離瓜果腐霉等腐霉屬卵菌，可解決瓜果腐霉等植物病原腐霉分離過程中各種非目標真菌和細菌污染嚴重的問題，且速度快，效率高，省時、省力。
文檔編號A01N47/38GK102754655SQ20121025062
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者劉鵬飛, 賈睿哲 申請人:中國農業大學