專利名稱：甜瓜抗蔓枯病聚合基因的鑒定的制作方法
技術領域：
本發明公開了甜瓜抗蔓枯病聚合基因鑒定的方法，專用于甜瓜抗蔓枯病聚合育種及分子標記輔助選擇，有利于開展甜瓜蔓枯病抗病品種的選育與種質資源的創制，屬于植物生物技術領域。
背景技術：
在甜瓜抗蔓枯病研究領域，國際上發現含有不同抗性基因的5份抗源材料PI140471、PI157082、PI511890、PI482398 和 PI482399,其抗性基因分別命名為 Gsb-UGsb-2、Gsb-3、Gsb-4和Gsb_5。PI420145是最新篩選出的蔓枯病抗源，通過遺傳分析，該抗源的抗性基因也為單顯性。這6份抗源的蔓枯病抗性均由單個基因控制，但是隨著栽培環境的和病原物致病性的改變，攜帶單個抗蔓枯病基因的抗源已不能提供足夠的、穩定的抗病性。多個抗性基因聚合后，并不簡單的表現為單個抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是 抗性基因之間表現為基因互作，這樣能夠擴大抗譜，增加抗源的抗性。因此，在進行甜瓜蔓枯病抗性育種時將多個抗蔓枯病基因同時導入改良親本，是獲得持久、高抗蔓枯病甜瓜品種的重要途徑之一。可通過兩份抗蔓枯病材料常規雜交將抗性基因聚合到一份抗源中、連續自交多代穩定抗性，實現抗蔓枯病基因的聚合。在聚合的過程中，運用表型結合分子標記技術輔助選擇，分子標記輔助選擇通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記鑒別目標基因是否存在，不受基因表達、環境條件及植株生長發育階段的影響，也不受雜交方式的影響，在植株的苗期或低世代就可進行篩選，可以縮短選擇年限，提高育種效率。

發明內容
技術問題本發明甜瓜蔓枯病抗性基因聚合鑒定，目的是針對單一抗源抗性基因抗性不足，不持久等缺點，發掘出甜瓜蔓枯病聚合抗病基因資源，為甜瓜的蔓枯病抗病育種提供基因資源和標記輔助選擇的技術，從而大大提高選擇效率。將不同的抗性基因聚合在同一品種中可以提高抗性，拓寬抗譜，達到持久抗性的目的，加快培育優良抗蔓枯病甜瓜品系的進程。技術方案以抗蔓枯病材料PI 420145作為母本，與另一抗蔓枯病材料PI482398進行雜交，得到F1, F1自交，每代經蔓枯病菌抗性鑒定選出抗蔓枯病植株連續自交三代得到F4, F4經人工接種抗性鑒定，篩選抗蔓枯病遺傳穩定的植株。對F4抗蔓枯病甜瓜植株進行抗性基因鑒定。用3個AFLP分子標記對抗病材料PI420145、感病材料白皮脆以及40份F4材料進行PCR擴增，結果表明，PI420145和40份F4材料中在200、90、60bp處均擴增出一條特異條帶，與這3個引物在抗病材料PI420145上擴增的特異的條帶完全完全一致，表明F4含有PI420145的抗蔓枯病基因，感病對照白皮脆未檢測出該特異條帶。用SSR標記CMAT170a對抗病材料PI482398、感病材料白皮脆以及40份F4材料進行PCR擴增，PI482398和40份F4材料在120bp處均擴增出一條特異條帶，與該引物在抗病材料PI482398上擴增的特異條帶一致，表明F4含有抗蔓枯病基因Gsb_4，感病對照白皮脆未檢測出這些條帶。則這40份F4材料聚合了 PI420145和PI482398抗蔓枯病基因。有益效果本發明所提供的甜瓜抗蔓枯病基因聚合方法及其鑒定具有以下優點I)本發明通過2個甜瓜抗蔓枯病材料PI420145和PI 482398雜交和連續自交三代，得到F4，獲得甜瓜2個抗蔓枯病基因聚合的材料，其抗性穩定，且抗性大于單一抗源。2)本發明創制的甜瓜抗蔓枯病基因聚合材料F4，可作為抗性親本進行抗病育種，通過與性狀優良的商品種雜交、回交，獲得抗蔓枯病的優異甜瓜品種。對甜瓜抗蔓枯病育種及種質創新具有重要意義?！に?br>
圖I :SSR引物CMAT170a在抗源PI482398、白皮脆和聚合抗源后代F4上擴增的結果表明聚合抗源后代F4中含有抗源PI482398的抗蔓枯病基因。其中，M:Marker，l :抗蔓枯病單株PI482398，2 :感蔓枯病單株白皮脆，3 :聚合抗源PI420145XPI482398。箭頭示為出現的特異帶。
圖 2 =AFLP 引物 EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60在抗源PI420145、白皮脆和聚合抗源后代匕上的擴增結果表明后代F4中含有抗源PI420145的抗蔓枯病基因。
其中，I:抗蔓枯病單株PI420145 ;2:感蔓枯病單株白皮脆；3:聚合抗源PI420145XPI482398。
箭頭示為出現的特異帶。
五具體實施例方式本發明甜瓜抗蔓枯病基因聚合及分子標記鑒定的實施程序包括(I)將抗源PI420145(早)和抗源PI482398( ^ )進行雜交，對雜交后代F1進行田間接種鑒定，篩選抗性植株自交，對自交后代進行蔓枯病菌接種鑒定，篩選出抗病植株，連續自交3代，得到抗蔓枯病后代F4，對F4接種鑒定篩選抗性植株，取幼嫩葉片，用CTAB法提取DNA，進而用AFLP和SSR標記鑒定蔓枯病抗性基因。(2)抗蔓枯病菌鑒定抗源PI420145、PI482398、感病材料白皮脆和后代匕人工接種鑒定，其發病率和病情指數如下表I :表I抗蔓枯病接種鑒定
權利要求
1.甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料創制方法 通過抗蔓枯病材料PI 420145作為母本與父本抗蔓枯病材料PI482398(Gsb-4)進行雜交，自交，室內PCR鑒定，田間抗性篩選和農藝性狀選擇，連續自交三代得到F4，在F4中篩選出PI 420145和PI482398抗蔓枯病基因聚合的純合株系。
2.PI 420145、PI482398抗蔓枯病基因分子標記定位 已篩選出 3 個 AFLP 分子標記 EcoRI-TG/MseI-CTC200, EcoRI-AT/MseI_CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60與PI420145的抗蔓枯病基因連鎖；篩選到一個SSR標記與PI482398的抗蔓枯病基因連鎖，該標記為CMAT170a，用該SSR標記能擴增出長度約為120bp的DNA片段。
3.甜瓜PI420145 X PI482398 F4抗蔓枯病基因聚合，其特征在于 PI420145、PI482398蔓枯病抗基因均為單顯性。PI420145XPI482398的自交后代F4 聚合了 PI420145 和 PI482398 抗蔓枯病基因，三個 AFLP 標記 EcoRI-TG/MseI_CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60，在 F4 和 PI420145 上分別擴增出相同大小的特異片段。SSR標記CMAT170a在F4和PI482398上均擴增出長度大小約為120bp的特異片段?；厥誂FLP和SSR特異條帶，克隆測序，F4上擴增出的特異片段與在PI 420145,PI482398上擴增出的特異片段大小、序列均相同。
全文摘要
本發明的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合方法及其鑒定專用于甜瓜抗蔓枯病聚合抗源篩選以及抗蔓枯病標記輔助聚合育種研究。兩個抗蔓枯病材料PI420145和PI482398雜交、后代連續自交得到抗蔓枯病基因穩定遺傳的F4，F4聚合了PI420145和PI482398的抗蔓枯病基因，且聚合后抗源的聚合抗源的抗性增強，抗性高于親本。PI420145和PI482398雜交及自交后代F4聚合雙親的蔓枯病抗性基因，該抗源的蔓枯病抗性基因與AFLP標記EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60連鎖，同時SSR標記CMAT170a連鎖。通過本發明提供的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合及其鑒定方法，獲得聚合基因材料，其抗性高于單一抗源，大大提高抗蔓枯病甜瓜的選擇效率，在甜瓜抗蔓枯病育種中，該聚合抗源可做為供體親本，能夠加速甜瓜抗蔓枯病育種進程。
文檔編號A01H1/04GK102845300SQ20121025456
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者陳勁楓, 徐兵劃, 錢春桃, 婁群峰, 王紅英 申請人:南京農業大學