來源于羊草與耐低溫相關的轉錄因子及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種源于羊草并與植物耐低溫相關的蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白質是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關的由序列1衍生的蛋白質。實驗證明，-8℃低溫脅迫處理24h后第14天，野生型擬南芥植株有約81%的植株出現葉片失水萎蔫癥狀，葉片顏色變白，部分或全部死亡；而轉LcWRKY3基因擬南芥苗植株有約84%的植株生長正常，只有約16%的植株出現葉片發白癥狀，可見本發明對于培育耐冷性提高的植物新品種具有重要理論和實際意義，可用于農牧業和生態環境治理所需抗性植物品種的培育與鑒定，具有較高際應用價值。
【專利說明】來源于羊草與耐低溫相關的轉錄因子及其編碼基因與應用【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種源于羊草并與植物耐低溫相關的蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種來源于WRKY家族的羊草冷誘導轉錄因子及其編碼基因與在培育耐低溫性提高的植物中的應用。
【背景技術】
[0002]低溫脅迫是影響植物正常生長的主要障礙因子之一，植物尤其是經濟作物的抗冷性強弱直接影響作物產量。目前抗冷基因的鑒定多集中于擬南芥、水稻等模式植物以及玉米和棉花等重要農作物。它們多為熱帶起源的植物，都不能忍受冷環境，0°c~12°C即造成傷害。因此，亟需從其它抗冷性強的植物中挖掘相關基因。我國是世界上生物多樣性最豐富的國家和主要作物的起源中心之一，不僅植物遺傳資源種類多，而且許多是適應惡劣極端環境的野生種，這些物種在抗寒、抗旱和耐鹽堿等方面具有明顯的優勢，是當前和未來農業可持續發展的基礎。長期以來，人們對植物響應冷脅迫的機制已經從生理、生化、代謝、生態、以及遺傳、進化等角度進行了很多研究，積累了豐富的知識。近年來，隨著分子生物學的發展，人們進一步在基因組成、表達調控及信號傳導等分子水平上加深了對植物抗冷機理的認識，為利用基因工程方法改良植物的抗冷性能提供了堅實的基礎。由于植物抗逆性狀的復雜性，采用傳統的育種方法提高植物的抗旱性十分困難。轉基因等基因工程方法為植物抗冷育種提供了有效途徑 ，但高效抗冷基因的分離是限制植物抗冷基因工程的關鍵因素。
[0003]WRKY轉錄因子是近年來新發現的植物特有新型鋅指型轉錄調控因子，因在其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守的7個氨基酸序列而得名。目前在擬南芥中共發現了74個WRKY成員，而水稻中則發現了 105個完整的WRKY成員。研究發現，WRKY結構域及其專一結合的(T) (T)TGAC(C/T)序列(又稱W-box)更多地存在于與抗病、損傷、衰老相關基因和水楊酸誘導基因的上游調控區域。
[0004]植物抗冷性受多基因調控，要使眾多對植物抗逆性狀產生作用的功能基因協調發揮作用，才能有效改良植物抗冷性。由于一個抗冷相關轉錄因子可以調控多個基因的表達，增強一個轉錄因子的作用就可使植株的抗冷性狀得到綜合改善。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種與植物耐低溫相關的蛋白及其編碼基因和應用。
[0006]本發明所提供的蛋白質，名稱為LcWRKY3,來源于羊草(Leymus chinensis (Trin.)Tzvel.),是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0008](b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關的由序列I衍生的蛋白質。
[0009]上述(b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0010]序列表中序列I由338個氨基酸殘基組成。LCWRKY3蛋白在第270-330位氨基酸殘基間序列為一個保守的WRKY DNA結合域，221-227位氨基酸殘基間序列為可能的核定位信號 PRRRCSG。
[0011]為了便于LcWRKY3蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標簽。
[0012]表:標簽的序列
[0013]
【權利要求】
1.蛋白質，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關的由序列I衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子。
3.根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是編碼權利要求1所述蛋白質的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列2所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子為如下兩種中的任一種: (1)35S啟動子； (2)ADHl啟動子。
7.權利要求1所述的蛋白質，或權利要求2或3所述的核酸分子，或權利要求4或5或6所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al)或a2)中的應用: al)調控植物的耐低溫性； a2)選育耐低溫植物品種。
8.一種培育耐低溫性提高的轉基因植物的方法，包括將編碼權利要求1所述蛋白質的基因導入目的植物中得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物與所述目的植物相比，耐低溫性提高。
9.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.權利要求1所述蛋白質在作為轉錄因子中的應用。
【文檔編號】A01H1/02GK103570812SQ201210256583
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月23日 優先權日:2012年7月23日
【發明者】劉公社, 程麗琴, 趙愛國, 陳雙燕, 齊冬梅 申請人:中國科學院植物研究所