經濟作物分生組織培養脫病毒新技術的制作方法
【專利摘要】本發明是一種可供經濟作物通用的脫病毒新技術，該技術包括5個方面技術內容：建立了無菌條件下最佳脫病毒效果的分生組織細胞團(生長點)大小，一般為0.2-0.5mm，但是在顯微鏡下應根據植物不同而異；才能夠取得最佳脫病毒效果；發現危害經濟作物的病毒主要為二種，即粒狀病毒和桿狀病毒；經過脫病毒的試管苗需要移栽到試驗田中，進行連續2-3年農藝性狀特征的記載鑒定，才能確認脫病毒苗的增產效果；再進行主要化學成分測定，以保證和提高農產品的質量；建立了可供經濟作物通用的生物技術脫病毒操作程序(SOP)；本發明技術達到了年生產脫病毒苗50-100萬株的工廠化技術水平，脫病毒苗增產效果可以達到50％以上。
【專利說明】經濟作物分生組織培養脫病毒新技術
[0001]?【技術領域】:農業生物新技術
?【背景技術】:
[0002]我國近年來經濟作物發展很快?？墒牵洕魑锖苋菀赘腥径喾N病毒病，尤其是以無性繁殖為主的經濟作物，病毒病十分嚴重，感染了病毒病的經濟作物葉子皺縮，生長緩慢，植株矮化，產量一年比一年低、品質差，一般減產30-80%。并逐年加重。經濟效益大幅度下降，嚴重地阻礙了經濟作物生產的發展。目前對病毒病還沒有有效的農藥進行防治，即使有一些農藥可用，但是病毒病防治效果很差，還往往引起農藥殘留超標，病毒病已經成為經濟作物生產的“癌癥”。
[0003]為了解決經濟作物廣泛存在的病毒病危害問題，我們應用生物新技術，經過5年脫病毒技術研究工作，先后在薄荷，百合等系列經濟作物上研究成功了高效快速脫病毒新技術:研究工作主要包括:
[0004]1.進行蘇薄荷和百合的組織培養脫病毒方法技術研究，建立全套方法和技術。
[0005]2.對篩選獲得的脫病毒株系進行組織培養快速繁殖，以建立各株系的克隆試管苗。
[0006]3.把脫病毒試管苗分株系移栽到試驗田中，進行農藝性狀特征的田間記載和產量鑒定。
[0007]4.針對經濟作物的特殊性，進行化學成分測定，以保證和提高農產品的質量。
[0008]5.對經2-3年連續選育鑒定出的脫病毒徹底的優良品系進行試管苗克隆化快速繁殖，以便提供進行進一步產業化生產試種示范。
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【發明內容】
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[0009]本專利技術是經過20多年進行生物技術脫病毒的研究工作而建立起來的，應用本項目的技術，脫病毒效果可以達到90-100%，同時脫病毒薄荷，百合苗已經在生產上應用試驗10年，應用試驗點達到100余個，脫病毒技術已經通過了江蘇省科技廳組織的科技成果鑒定，應用本專利技術培育出來的脫毒苗在各地生產試驗中均表現出明顯的增產效果，增產效果達到50%左右，一般來說，薄荷，百合感病毒愈嚴重，應用脫病毒苗后的增產效果愈明顯；本專利技術包括以下5個方面的技術內容:
[0010]1.以薄荷和百合為模式經濟作物，首先進行了無菌條件下的組織培養脫病毒方法技術研究，建立全套方法和技術。薄荷和百合是典型的無性繁殖經濟作物，長期的無性繁殖和連作種植，必然產生多種病毒侵染，嚴重影響薄荷和百合的正常生長，這也是薄荷和百合品種容易退化的主要原因之一。對于病毒病，目前尚無有效的防治措施，我們針對不同類型的經濟作物，在顯微鏡下解剖得到不同大小莖尖分生組織，在特殊的啟動培養基上進行細胞培養，然后經過細胞分裂，生長成為叢生芽，無根苗和試管苗生根四個階段的培養過程，獲得的試管苗就可以移植到苗床，培育出脫病毒大苗，進行生產鑒定和種植。
[0011]對于經過分生組織培養得到的試管苗，還需經過電子顯微鏡檢測，確定是否已經脫去病毒，從中鑒定出完全不帶病毒的植株作為繁殖材料。我們采用電鏡法對薄荷，百合，草莓生姜，半夏等一系列經濟作物進行了病毒病的檢測。結果表明:影響經濟作物產量和質量的主要病毒為:黃瓜花葉病毒(CMV)和.煙草花葉病毒檢測(TMV)。
[0012]2.對篩選獲得的脫病毒株系進行組織培養快速繁殖，以建立各株系的克隆試管苗。
[0013]對經過脫病毒工作后獲得的材料，每個樣品材料均在20個視野進行病毒檢查。對未觀察到了任何桿狀病毒粒子，(TMV);也沒有發現球狀病毒(CMV);的材料，我們作為優質脫毒苗進行了加速繁殖和進一步田間鑒定。
[0014]3.把脫病毒試管苗分株系移栽到試驗田中，進行農藝性狀特征的田間記載和產量鑒定。
[0015]植株農藝性狀的鑒定:采取定株觀測的方法，每株系選取20株，于七月中下旬采收期對其株高、葉長、葉寬、莖粗、節數、分枝數、基部長度進行了測定。葉面積用第10對葉寬和葉長的乘積表示，并用螺旋測微器測量該處的莖粗?；块L度選取地面上5節測量。分別計算其平均值。對脫毒和未脫毒百合的田間農藝性狀也同樣進行了類似的觀察與測定。與未脫毒百合相比，脫毒菊鱗莖直徑明顯增加，植株高大，葉片寬厚。明顯顯示出較強的生長優勢。
[0016]4.針對經濟作物的特殊性，進行化學成分測定，以保證和提高農產品的質量。
[0017]我們分別對薄荷和百合進行了主要化學成分的測定和分析；在薄荷化學成分測定中，我們對各株系揮發油含量，薄荷醇含量的質量指標進行了測定七月中下旬當植株普遍現蕾，開花10%左右(花開至3輪)時，選天氣連續晴5~7d后晴天上午露水干后開始收害I]，將收割的薄荷陰干，切去下面無葉老莖，按《中國藥典》(2000版)附錄XI揮發油測定方法提取揮發油，讀取毫升數。 揮發油含量以每克鮮草毫升數計。
[0018]進行了百合多倍體試管苗和脫病毒試管苗及百合未脫毒試管苗的生物堿和多糖的含量測定，實驗結果表明脫病毒試管苗的總糖及生物堿含量均高于未脫毒試管苗，為選育優良品種提供了依據。綜合百合生物堿和多糖含量的測定結果，篩選出6個生長勢強，生物堿含量高的脫病毒品系作為今后進一步生產應用的優良株系。
[0019]5.對經2-3年連續選育鑒定出的脫病毒優良品系進行試管苗克隆化快速繁殖，提供進行進一步產業化生產試種示范。脫病毒試管苗培育成功后，還需要解決快速繁殖(克隆化)的問題，才能在生產上應用推廣，為此我們在培養基試驗中，進行了一系列培養基的優化試驗，經過多年試驗，分別得到了百合，薄荷等系列經濟作物的最佳叢生芽繁殖培養基配方，最佳生長培養基配方，試管苗生根培養基配方，應用該系列培養基配方，可以達到年生產脫病毒薄荷，百合苗50-100萬株的技術水平，完全可以滿足脫毒薄荷，百合大面積生產中對脫病毒試管苗的大量需求。
?【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1是主要病毒之一粒狀病毒的電子顯微鏡照片的圖；
[0021]圖2是主要病毒之二桿狀病毒的電子顯微鏡照片的圖；
[0022]圖3是大量脫病毒試管苗在實驗室培育照片的圖；
[0023]圖4是產量高，生長健壯的脫毒薄荷苗(無病毒薄荷)的圖；[0024]圖5是經過生物技術脫病毒后生產出來的百合產品的圖；
圖6是高產，優質的脫病毒百合商品的圖。
?【具體實施方式】:
[0025]本專利的技術流程:
[0026]1.采集薄荷，百合等經濟作物優良品種的感病毒材料(芽或者鱗莖)
[0027]2.將芽或者鱗莖作為外植體洗凈，置于流水沖洗10分鐘。
[0028]3.小心剝去外部葉片或者鱗片3-5張，取出中心芽。
[0029]4.對有病毒的薄荷，百合芽進行高溫短時預處理(40_50°C 5-20分鐘)。以殺死或者鈍化部分病毒。
[0030]5.對薄剝去外部葉片的芽先后用0.1 %氯化汞，2%次氯酸鈉消毒10分鐘。
[0031]6.將無菌狀態的薄荷，百合芽，置于體視顯微鏡下，進行無菌解剖。取出02-0.5mm的分生組織(生長點)其中薄荷以0.2-0.4毫米為宜，百合以0.3-0.5毫米為宜。
[0032]7.在無菌條件下，將生長點置于最優化的細胞啟動培養基上進行啟動培養40天，(MS+BA0.5-2.0ppm+IAA0.1-0.2ppm)。獲得無病毒愈傷組織。
[0033]8.在無菌條件下，將無病毒愈傷組織轉移到繁殖培養基上，培養30天獲得大量叢生芽。
[0034]9.在無菌條件下，將獲得大量叢生芽轉移到生長培養基上，經過30天的培養，叢生芽生長成為無根試管苗。
[0035]10.在無菌條件下，將無根試管苗轉移到生根培養基上培養20天，生長成為可以移栽的有根試管苗。
[0036]11.將脫病毒試管苗移植到育苗苗床，經過1-2月的培育，培育成為脫毒原種苗。
[0037]12.經過脫病毒的原種苗移栽繁殖田中進行自然條件下的繁殖，經過2-3月的田間繁殖就可以繁殖出20-30倍的脫病毒大苗。
[0038]13.將脫病毒大苗移植到試驗田中，進行連續2-3年農藝性狀特征的田間記載鑒定。確認了脫病毒苗的明顯增產效果。
[0039]14.針對經濟作物的特殊品質要求，進行了主要化學成分測定，以保證和提高農產品的質量。
[0040]15.對于經過產量，質量鑒定確定為高產優質的脫病毒苗，進一步進行實驗室組織培養克隆化快速繁殖，在本專利技術工藝條件下，脫病毒試管苗的繁殖可以達到每年50-100萬倍的繁殖速度，完全可以滿足今后大面積產業化生產對脫病毒苗的大量需求，達到大面積推廣應用脫病毒苗的要求。提供進行生產示范推廣和應用。
【權利要求】
1.應用生物新技術，進行分生組織細胞培養脫病毒新技術的研究，以經濟作物--蘇薄荷和百合為模式研究對象，建立了最佳生長點大小(0.2-0.6毫米)，最佳脫病毒效果的新技術，建立了全套方法和可供開發應用的程序。
2.通過多年經濟作物脫病毒試驗研究，發現經濟作物中存在的病毒病主要為二種，即粒狀病毒好桿狀病毒。
3.針對經濟作物的特殊品質要求，分別優化建立了薄荷和百合主要化學成分-薄荷醇，百合多糖的快速測定方法，以保證和提高農產品的質量。
4. 為了滿足生產上對脫病毒優質種苗的大量需求，對選育鑒定出的脫病毒優良種苗，建立了試管苗克隆化快速繁殖技術，培養基配方，和試管苗最佳育苗技術，達到了每年可生產50-100萬試管苗的工廠化育苗的工藝技術水平。
【文檔編號】A01H4/00GK103563743SQ201210277951
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優先權日:2012年8月7日
【發明者】高敏, 高山林 申請人:高山林, 高敏