專(zhuān)利名稱(chēng)：一種海帶配子體克隆培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海帶配子體克隆的培育方法，尤其涉及海帶配子體克隆的無(wú)菌培育方法。
背景技術(shù)：
海帶，學(xué)名Laminaria japonica Aresch,褐藻的一種，生長(zhǎng)在海底的巖石上，形狀像帶子，含有大量的碘質(zhì)，屬于褐藻門(mén)，褐子綱，海帶目，海帶科，海帶屬。藻體褐色，長(zhǎng)帶狀，革質(zhì)，一般長(zhǎng)2 6米，寬20 30厘米。藻體明顯區(qū)分為固著器、柄部和葉片。固著器假根狀，柄部粗短圓柱形，柄上部為寬大長(zhǎng)帶狀的葉片。海帶具有極高的養(yǎng)殖價(jià)值，然而優(yōu)良養(yǎng)殖品種的選育過(guò)程復(fù)雜、漫長(zhǎng)。海帶配子體在單獨(dú)分離培養(yǎng)時(shí)可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)形成無(wú)性繁殖系(克隆)，其遺傳性純一，可長(zhǎng)期保存，具有發(fā)育全能性并可雜交。海帶配子體克隆作為海帶種質(zhì)資源保存和利用的主要材料，在育種、育苗研究中發(fā)揮著重要作用。利用海帶雌雄 配子體克隆配對(duì)雜交技術(shù)可以有效縮短選育周期，獲得性狀優(yōu)良的雜交海帶。這一技術(shù)在近些年的海帶育種工作中得到有效運(yùn)用。目前常規(guī)采用的海帶配子體克隆培育方法，是通過(guò)簡(jiǎn)單擦洗(用120°C烘干消毒的脫脂棉沾取制冷至10°C的煮沸消毒海水擦洗種海帶，去除表面的雜藻等附著物)種海帶后進(jìn)行游孢子放散、附著，待游孢子發(fā)育成配子體后用微吸管分離獲得單個(gè)雌、雄配子體，在一定條件下將雌雄單獨(dú)個(gè)體分離成功的海帶配子體克隆培養(yǎng)在含營(yíng)養(yǎng)鹽的培養(yǎng)液中，放置于溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強(qiáng)度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在此條件下，海帶配子體可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，形成無(wú)性繁殖系，培養(yǎng)使配子體進(jìn)行無(wú)性繁殖形成單克隆系，所有操作在常規(guī)室內(nèi)進(jìn)行。但該方法由于種海帶和環(huán)境空氣消毒不徹底，極易發(fā)生細(xì)菌、真菌及雜藻污染，從而影響了配子體生長(zhǎng)和成活率，不利于長(zhǎng)期保存，又極大地增加了污染處理的工作量，最終導(dǎo)致種質(zhì)資源損失。而且該方法體系穩(wěn)定性較差，難以進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以長(zhǎng)期保存，且可以保持穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)的海帶配子體克隆培育方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是(I)剪取種海帶塊剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊；(2)種海帶塊的預(yù)處理用滅菌脫脂棉蘸取經(jīng)制冷至10°C的煮沸消毒海水，對(duì)帶有成熟孢子囊的種海帶塊進(jìn)行充分擦洗；(3)種海帶塊的消毒在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，預(yù)處理過(guò)的種海帶塊首先用無(wú)菌雙抗海水浸泡30分鐘，然后用I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水溶液浸泡10分鐘，最后用無(wú)菌海水浸泡20分鐘；(4)游孢子的放散、過(guò)濾在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌鑷子夾取消毒后的種海帶塊，快速移入裝有無(wú)菌海水的血清瓶中進(jìn)行游孢子放散，放散后的無(wú)菌海水成為含有游孢子的孢子水，孢子水經(jīng)篩絹過(guò)濾，濾出粘液及雜質(zhì)；(5)游孢子的附著和培養(yǎng)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，過(guò)濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當(dāng)游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無(wú)菌雙抗海水，使載玻片完全浸泡在無(wú)菌雙抗海水中，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側(cè)用封口膜拉伸封口進(jìn)行培養(yǎng)即可得到發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個(gè)雌雄配子體分別分離至兩個(gè)不同的血清瓶中，每個(gè)血清瓶分別用無(wú)菌雙抗海水進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到單細(xì)胞的海帶配子體克隆團(tuán)。上述步驟(4)中，所述篩絹為400目的經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的篩絹。上述步驟(5)中，所述無(wú)菌雙抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和鏈霉素，有效氮濃度為IOppm,有效磷濃度為Ippm,青霉素濃度為120ppm,鏈霉素濃度為lOOppm。所述 培養(yǎng)條件是溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強(qiáng)度800 12001UX。上述無(wú)菌海水、I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水和無(wú)菌雙抗海水均在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，經(jīng)O. 22um濾膜抽濾。本發(fā)明的技術(shù)效果是本發(fā)明對(duì)種海帶和培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行全面消毒，除預(yù)處理外所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以無(wú)菌雙抗海水作為培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中持續(xù)光照培養(yǎng)，可有效避免污染，而且海帶配子體生長(zhǎng)和發(fā)育狀態(tài)正常，使用本發(fā)明方法培育獲得的海帶配子體克隆性狀穩(wěn)定，生長(zhǎng)正常，成活率高，能有效避免污染，適于長(zhǎng)期保存，可大大減少工作量，降低培育成本，根本上解決現(xiàn)有方法中的污染問(wèn)題。應(yīng)用本發(fā)明方法，不僅可以使海帶配子體克隆在無(wú)菌的條件下長(zhǎng)期保存，且可以保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)。


I、圖I為本發(fā)明微吸管分離后培育10天放大100倍的海帶配子體克隆照片。2、圖2為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)45天的海帶配子體克隆(直徑O. 5 Imm)照片。3、圖3為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)4個(gè)月的海帶配子體克隆(直徑約4 5_)照片。4、圖4為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)8個(gè)月的海帶配子體克隆(克隆團(tuán)松散后)照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明一種海帶配子體克隆培育方法通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的I、剪取種海帶塊剪取具有優(yōu)良性狀、無(wú)病爛、未放散的成熟海帶孢子囊部分，SP剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊。養(yǎng)殖海帶為一年生，養(yǎng)殖海帶的孢子囊一般在每年的5 8月出現(xiàn)；野生海帶為兩年生，野生海帶孢子囊一般在每年的10 11月出現(xiàn)。2、種海帶塊的預(yù)處理對(duì)帶有成熟孢子囊的種海帶塊進(jìn)行預(yù)處理，即用滅菌脫脂棉蘸取經(jīng)制冷至10°c的煮沸消毒海水，對(duì)帶有成熟孢子囊的種海帶塊進(jìn)行充分擦洗，擦洗到在不損傷孢子囊的情況下，以去除種海帶塊表面的粘液、雜藻及其它附著物。
3、種海帶塊的消毒在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，種海帶塊首先用無(wú)菌雙抗海水浸泡30分鐘，然后用I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水溶液浸泡10分鐘，最后用無(wú)菌海水浸泡20分鐘。上述操作步驟均在直徑為9厘米的培養(yǎng)皿中進(jìn)行。4、游孢子的放散、過(guò)濾在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌鑷子夾取消毒后的種海帶塊，快速移入裝有150ml無(wú)菌海水的200ml血清瓶中進(jìn)行游孢子放散。上述滅菌處理種海帶的過(guò)程相當(dāng)于進(jìn)行了陰干處理，放入血清瓶后，海帶孢子囊壁破裂，游孢子放出。當(dāng)游孢子密度達(dá)到每視野(目鏡16X物鏡10倍)15 25個(gè)時(shí)，孢子水(含有游孢子的無(wú)菌海水)經(jīng)400目的高溫高壓滅菌過(guò)的篩絹過(guò)濾，濾出粘液及雜質(zhì)。5、游孢子的附著和培養(yǎng)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，過(guò)濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，在8 10°C條件下，經(jīng)O. 5 3小時(shí)，游孢子附著于載玻片上形成胚孢子，當(dāng)載玻片附著密度達(dá)到每視野(16X10倍)5 10個(gè)時(shí)結(jié)束，倒掉孢子水，加入無(wú)菌雙抗水作為培養(yǎng)液，使載玻片完全浸泡在無(wú)菌雙抗水中即可，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側(cè)用封口膜拉伸封口，即在立式染色缸缸口與 缸蓋結(jié)合縫處用封口膜封口，放置于溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強(qiáng)度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天左右，即可發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個(gè)雌(雄)配子體分別分離至兩個(gè)不同的IOml血清瓶中，每個(gè)血清瓶分別用5 IOml無(wú)菌雙抗水作為培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)也在溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強(qiáng)度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10天左右形成肉眼可見(jiàn)的海帶配子體克隆團(tuán)。本發(fā)明煮沸消毒海水、無(wú)菌海水、I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水和無(wú)菌雙抗海水制作方法I、制備煮沸消毒海水即生海水經(jīng)煮沸消毒的海水，生海水裝入玻璃三角燒瓶?jī)?nèi)，在煤氣灶上煮沸，沸騰2 3分鐘即可，然后在玻璃三角燒瓶口用紙蓋封口，用冰箱在5 IO0C的溫度下冷藏保存?zhèn)溆谩?、制備無(wú)菌海水在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，弱風(fēng)條件下，酒精燈火焰前，煮沸消毒海水經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾，首先將O. 22um(0. 22微米)濾膜裝入IL的筒式正壓過(guò)濾器后通過(guò)高溫高壓濕熱滅菌和烘干，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將煮沸消毒海水添加至筒式正壓過(guò)濾器中，用抽濾泵抽濾，使液體通過(guò)濾膜流到已滅菌的血清瓶中，蓋上瓶蓋，制成無(wú)菌海水。由于煮沸消毒的海水不能達(dá)到無(wú)菌要求，經(jīng)O. 22um濾膜可以有效濾出海水中的微小雜質(zhì)及細(xì)菌，可以達(dá)到除菌99. 99%的要求，在血清瓶的瓶口與瓶蓋結(jié)合縫處用封口膜封口，封口膜為半透明、有韌性的熱塑性塑料，能緊緊而且自動(dòng)密閉形成在瓶口，起到密封作用，用冰箱在5 10°C的溫度下冷藏保存?zhèn)溆谩?、制備I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水15克碘化鉀(化學(xué)式KI，分析純)溶于IOOOml的煮沸消毒海水后，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，弱風(fēng)條件下，酒精燈火焰前，經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾至血清瓶，制成I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水，用封口膜封口，溫度5 10°C下保存?zhèn)溆谩. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水的O. 22um濾膜抽濾同制備無(wú)菌海水的O. 22um濾膜抽濾相同。4、制備無(wú)菌雙抗海水稱(chēng)取O. 243克硝酸鈉(分子式NaNO3,分析純)、0· 018克磷酸二氫鉀(分子式KH2PO4，分析純)、0. 48克青霉素(醫(yī)用，80萬(wàn)單位)、0. 4克鏈霉素(醫(yī)用，每克100萬(wàn)單位)溶于4000ml煮沸消毒海水后，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，弱風(fēng)條件下，酒精燈火焰前，經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾至血清瓶，制成含有效氮(NO3-N) IOppm(即濃度為百萬(wàn)分之十的有效氮)、有效磷(PO4-P) lppm(即濃度為百萬(wàn)分一的有效磷)，青霉素120ppm(即濃度為百萬(wàn)分之一百二十的青霉素)和鏈霉素100ppm(即濃度為百萬(wàn)分之一百的鏈霉素)的無(wú)菌雙抗海水，封口膜封口，5 10°C保存?zhèn)溆谩Ｖ苽錈o(wú)菌雙抗海水的O. 22um濾膜抽濾同制備無(wú)菌海水的O. 22um濾膜抽濾相同。本發(fā)明實(shí)施例采用如下試劑和器材碘化鉀(KI):上海銀典化工有限公司，分析純硝酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純磷酸二氫鉀國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純青霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，注射用青霉素鈉，80萬(wàn)單位
鏈霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，注射用硫酸鏈霉素，100萬(wàn)單位立式染色缸玻璃材質(zhì)，可放5片載玻片，50 60ml的容量壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)，型號(hào)為L(zhǎng)DZX-75KB超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為SW-CJ-IDO. 22um濾膜上海市新亞凈化器件廠(chǎng)，混合纖維膜筒式正壓過(guò)濾器上海市新亞凈化器件廠(chǎng)，規(guī)格為I升，材質(zhì)為不銹鋼電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號(hào)為0HG-924385-III。本實(shí)施例無(wú)菌室采用提前2小時(shí)臭氧消毒或紫外燈消毒，臭氧消毒采用臭氧發(fā)生器持續(xù)消毒30分鐘，臭氧濃度為80mg/m3。超凈工作臺(tái)提前10分鐘用紫外燈消毒,紫外燈持續(xù)消毒30分鐘。本實(shí)施例種海帶塊的消毒、游孢子的放散和過(guò)濾、游孢子的附著和培養(yǎng)均在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。本實(shí)施例所用物品，如培養(yǎng)皿，裝有濾膜的筒式正壓過(guò)濾器，夾取種海帶的鑷子，放散用的血清瓶，過(guò)濾用的400目篩絹，放有載玻片的立式染色缸，附著結(jié)束后盛放廢棄孢子水的燒杯均經(jīng)壓力蒸汽滅菌器的高溫高壓濕熱滅菌，即上述需要消毒的物品用牛皮紙包好，裝入滅菌用的布袋中，扎好布袋口，入壓力蒸汽滅菌器，在溫度120°C，壓力O. 165Mpa，滅菌15分鐘，滅菌后裝有物品的布袋再放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱在溫度120°C下干燥120分鐘進(jìn)行烘干。本實(shí)施例滅菌脫脂棉系脫脂棉在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在溫度120°C下滅菌120分鐘。
權(quán)利要求
1.一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是 (1)剪取種海帶塊剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊； (2)種海帶塊的預(yù)處理用滅菌脫脂棉蘸取經(jīng)制冷至10°C的煮沸消毒海水，對(duì)帶有成熟孢子囊的種海帶塊進(jìn)行充分擦洗； (3)種海帶塊的消毒在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，預(yù)處理過(guò)的種海帶塊首先用無(wú)菌雙抗海水浸泡30分鐘,然后用I. 5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水溶液浸泡10分鐘,最后用無(wú)菌海水浸泡20分鐘； (4)游孢子的放散、過(guò)濾在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌鑷子夾取滅菌消毒后的種海帶塊，快速移入裝有無(wú)菌海水的血清瓶中進(jìn)行游孢子放散，放散后的無(wú)菌海水成為含有游孢子的孢子水，孢子水經(jīng)篩絹過(guò)濾，濾出粘液及雜質(zhì)； (5)游孢子的附著和培養(yǎng)在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，過(guò)濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當(dāng)游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無(wú)菌雙抗海水，使載玻片完全浸泡在無(wú)菌雙抗海水中，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側(cè)用封口膜拉伸封口進(jìn)行培養(yǎng)即可得到發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個(gè)雌雄配子體分別分離至兩個(gè)不同的血清瓶中，每個(gè)血清瓶分別用無(wú)菌雙抗海水進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到單細(xì)胞的海帶配子體克隆團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(4)中，所述篩絹為400目的經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的篩絹。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(5)中，所述無(wú)菌雙抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和鏈霉素，有效氮濃度為lOppm，有效磷濃度為Ippm,青霉素濃度為120ppm,鏈霉素濃度為lOOppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(5)中，所述培養(yǎng)條件是溫度8 10°C，持續(xù)光照并且光照強(qiáng)度為800 12001UX。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于所述無(wú)菌海水、I.5%濃度的碘化鉀無(wú)菌海水和無(wú)菌雙抗海水均在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，經(jīng)0. 22um濾膜抽濾。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊；用滅菌脫脂棉蘸取煮沸消毒海水，對(duì)種海帶塊進(jìn)行擦洗；預(yù)處理過(guò)的種海帶塊分別用無(wú)菌雙抗海水浸泡30分鐘，1.5％濃度的碘化鉀無(wú)菌海水溶液浸泡10分鐘，無(wú)菌海水浸泡20分鐘；在血清瓶中進(jìn)行游孢子放散和過(guò)濾過(guò)濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當(dāng)游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無(wú)菌雙抗海水，再用微吸管將單個(gè)雌雄配子體分離至血清瓶中，然后用無(wú)菌雙抗海水進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到單細(xì)胞的海帶配子體克隆團(tuán)。使用本發(fā)明方法培育獲得的海帶配子體克隆性狀穩(wěn)定，成活率高，能有效避免污染，適于長(zhǎng)期保存。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102771394SQ201210279628
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者孫娟, 宋少峰, 張壯志, 李曉捷, 李言, 李霞, 王娜, 羅世菊, 賽珊, 趙楠, 錢(qián)冠蘭 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司