專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物應用領域。具體而言，本發明涉及一種解淀粉芽孢桿菌菌株及其用途。
背景技術：
種植業每年因病蟲害造成巨大的損失。病蟲害的防治有多種方法，其中化學防治在植物病蟲害的防治中發揮了巨大作用，為農業的增產、穩產和提高品質做出了重要貢獻。但是，過量施用和濫用農藥導致地力衰退和環境污染。尤其是近幾年來，農藥殘留超標的問題嚴重影響了人們的生活質量。目前，在蔬菜、水果等農作物的無公害栽培中，微生物農藥越來越受到重視。原因在干，它們不僅防治病蟲害的效果好，而且對環境友好、對農作物無污染，病蟲對其不易產 生抗藥性。因此，在生物農藥中，微生物農藥用途多、應用前景最為廣闊。芽孢桿菌屬細菌已較為廣泛地用于制備微生物農藥。芽孢桿菌屬細菌為好氧或兼性厭氧的桿菌，廣泛分布在水、空氣和土壌中；在孢子狀態下穩定性好，能耐氧化；耐擠壓；耐高溫，能長期耐60° C高溫，在120° C溫度下能存活20分鐘。目前芽孢桿菌屬用于防止病蟲害主要有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于高效防治植物病害的新的芽孢桿菌屬菌株——解淀粉芽孢桿菌。本發明的解淀粉芽孢桿菌菌株可以用作生物肥料以及生物農藥，具有良好的應用前景。本發明的另ー個目的是提供一種采用該新的解淀粉芽孢桿菌制備的發酵液和菌齊 。本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌，所述解淀粉芽孢桿菌的保藏編號為CGMCCNo.5043。本發明所提供的菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)LLM-002，是從山東省壽光市蔬菜大棚采用土壌稀釋分離法分離獲得的，已于2011年07月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 5043。其具有以下微生物學特性菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，兼性厭氧。NA培養基培養菌落圓形，白色，平展，表面粗糙，中間有圓環形突起，邊緣整齊。液體培養形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。該菌株的16S rRNA基因序列測定結果如下 CGGCGGCTGGCTCATAMGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAMCTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACMGGCCCGGGMCGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGT
CGAGTTGCAGACTGCGATCCGMCTGAGMCAGATTTGTGGGATTGGCTTMCCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATMGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCMCTGMTGCTGGCMCTMGATCMGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTMCCCMCATCTCACGACACGAGCTGACGACMCCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGMGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCMGACCTGGTMGGTTCTTCGCGTTGCTTCGMTTAMCCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCMTTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTMTGCGTTAGCTGCAGCACTMGGGGCGGAMCCCCCTMCACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTMTCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTT ACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGMTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCMGTTCCCCAGTTTCCMTGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTMGAMCCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCMTMTTCCGGACMCGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCMGGTGCCGCCCTATTTGMCGGCACTTGTTCTTCCCTMCMCAGAGCTTTACGATCCGAAMCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGMGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCMCTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTMGTGGTAGCCGMGCCACCTTTTATGTCTGMCCATGCGGTTCAMCMCCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGC該菌株的atpA基因序列測定結果如下GTTGGCCGGTGMCTTGTTGAGTTTTCAMCGGCGTTTTGGGTATGGCTCAAMCCTTGMGMTCCMCGTAGGTATCGTTATCTTAGGACCTTACAGAGATATCCGTGMGGTGATGAGGTCAAMGMCGGGCCGCATCATGGMGTTCCTGTAGGTGMGMTTMTCGGACGTATCGTCMCCCGCTCGGACAGCCGGTAGACGGACTGGGTCCGATTCTGACMGCAAMCACGTCCGATCGAMGCCAGGCTCCAGGCGTMTGGACCGTAMTCGGTACATGAGCCGCTGCAMCGGGTATCAMGCGATCGACGCGTTMTTCCGATCGGCCGCGGACAGCGTGAGCTGATTATCGGTGACCGTCAGACAGGTAAMCATCTGTTGCGATTGATACMTCTTAMCCAAAMGATCMGACATGATCTGTGTGTACGTAGCGATCGGCCAGAMGMTCTACAGTGCGCGGCGTAGTGGAMCACTTCGTMGCATGGCGCGCTTGATTACACGATTGTCGTGACGGCGTCCGCTTCACAGCCGGCTCCGCTTCTGTACCTTGCACCGTATGCAGGGGTGACMTGGGTGMGMTTCATGTACMCGGCMGCACGTTCTCGTCGTATATGATGATTTATCCAMCMGCGGCCGCTTACCGTGAGCTGTCATTGCTTCTTCGCCGTCCGCCGGGCCGTGMGCATTCCCTGGGGATGTATTCTATCTTCACTCCCGTCTGCTTGAGCGCGCAGCCMGCTGAGTGACGCAAMGGTGCAGGATCMTTACGGCGCTGCCGTTCGTCGAMCACMGCAGGAGATATCTCCGCTTATATCCCGACAMCGTCATTTCCATTACTGACGGACAGATTTTCCTTCMTCTGACCTATTCTTCTCAGGCGTGCGTCCTGCGATAMTGCCGGATTATCCGTTTCCCGTGTCGGCGGATCAGCCCAMTCAMGCGATGAAAMGGTAGCGGGMCATTGCGTCTTGACCTGGCTTCATACCGTGAACTTGAAGCGTTCGCCCAATTCGATC該菌株的分離方法為(I) 土樣采集從土壤表層到15cm處取樣200g，ー個地點采幾個樣本，混合過粗篩，取25g作分離用；(2)培養基平板制備將NA培養基(營養瓊脂培養基)和PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)培養基融化，分別倒入滅菌培養皿，冷卻，制成NA和PDA平板；
(3)稱取Ig 土樣于滅菌試管中，加IOOmL無菌水，振蕩，制成1(Γ2 土壤懸浮液，靜置5min，按10倍梯度稀釋到10_7 ；(4)取上述土壤懸浮液O. 5mL,加到培養基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養箱26 °C恒溫培養5-7d ；(5)將單個菌落在NA培養基上劃線，得到單菌落，轉移至NA試管斜面培養基中，至26 °C恒溫培養；(6)以黃瓜立枯病菌為祀標菌,米用平板對峙培養法,篩選到一株對黃瓜立枯病菌具有較強抑制活性的菌株，編號LLM-002。所述NA培養基配方為蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaC15g、瓊脂15g,蒸懼水IOOOmL ;所述PDA培養基配方為馬鈴薯(去皮切塊)300g,葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。本發明解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) (LLM-002) CGMCC No. 5043培養方法或繁殖方法普通培養采用NA培養基保存。實驗室液體培養采用NYBD液體培養基。NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，水lOOOmL，pH7. 3。大量發酵培養配方(重量百分含量):豆粉I. 8%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各0. 44%，魚粉0. 47%，硫酸鎂0. 01%,磷酸ニ氫鉀0. 03%，其余為水，pH7. 5。培養條件培養溫度26°C，培養時間72h，通風I :0. 8。采用此培養基發酵培養,發酵液菌數可達45億個/ml。另ー方面，本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌(CGMCC No. 5043)的發酵液，所述發酵液包含45億個/ml或以上的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043。所述發酵液通過包括以下步驟的方法制得將解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043在NB液體培養基培養得到種子液，然后將所述種子液接種到大量發酵培養基中發酵培養。其中所述NB液體培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 5%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各0. 44%，硫酸銨0. I %，硫酸鎂0. 01 %，磷酸ニ氫鉀0. 03%,其余為水，pH7. 5。所述大量發酵培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 8%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各0. 44%，魚粉O. 47%，硫酸鎂O. 01%,磷酸ニ氫鉀O. 03%,其余為水，pH7. 5。具體而言，所述方法包括以下步驟(I)將解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043接種至NA培養基試管斜面中，在26°C _28°C下恒溫培養2-3天；(2)在無菌條件下，將培養好的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043試管斜面菌種用無菌水稀釋，吸取稀釋菌液lmL，接種于高壓蒸汽滅菌后的NB液體培養基中，裝量200ml/500ml三角瓶，28°C下恒溫搖床振蕩培養廣2天，從而得到種子液；(3)按0. 5%的接種比例(體積比)將種子液接種到大量發酵培養基中，26°C—28°C下培養72小時，通風I :0. 8。發酵完成后，發酵液菌數可達45億個/g或以上。并且，本發明還提供一種解淀粉芽孢桿菌的菌劑，所述菌劑包含上述解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043發酵液；上述解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043發酵液作為活性成分，使得該菌劑具有廣譜殺菌活性。優選地，所述菌劑還包含輔助基質，所述輔助基質選自微粉碳酸鈣和膨潤土中的ー種或兩種。
所述菌劑的制備方法包括將本發明提供的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043的發酵液與輔助基質混合。根據發酵液的有效活菌數的數量與基質均勻混合，得到復合行業標準的微生物菌劑產品。該微生物菌劑可以用作生物肥料以及生物農藥，作為生物農藥可以防治植物多種病害。并且解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043通過葉面施用能夠防治作物、蔬菜、水果、林木等多種植物的根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病等。直接施用于土壤或者拌種可以預防黃瓜、豆類和花生等由大麗輪枝孢Verticilium daliae、錸刀菌Fusariumspp、曲霉屬 Aspergillus spp、鏈格抱屬 Alternaria spp 和絲核菌屬 Rhizoctonia spp 所引起的根部和種子的真菌病害。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) CGMCCNo. 5043還可以通過產生類似細胞分裂素、植物生長激素等物質，促進植物生長，抵抗病原菌的侵染。因此，又一方面，本發明提供解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043或者其發酵液或者本發明的菌劑在制備生物肥料或用于防治植物病害的生物農藥中的用途。 本發明還提供一種用于防治植物病害的方法，所述方法包括向具有病害的植物施用解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043或者其發酵液或者根據本發明的菌劑。針對上述用途和用于防治植物病害的方法，所述植物病害選自真菌病害，優選根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病等真菌病害中的ー種或多種，進ー步優選立枯病。本發明還提供ー種用于促進植物生長的方法，所述方法包括向植物施用解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043或者其發酵液或者本發明的菌劑。實驗表明，本發明的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043發酵液防治保護黃瓜立枯病效果顯著，防治效果達到72. 99%，且黃瓜生長健壯，無藥害產生。同時具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少抗生素藥物的使用，增強免疫カ的優點，因而在生物防止病蟲害中有重要應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進ー步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例I 解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) LLM-002 (CGMCCNo. 5043)的分離與鑒定I.分離本發明的解淀粉芽孢桿菌是從山東省壽光市蔬菜大棚采用土壌稀釋分離法分離獲得的，分離方法為(I) 土樣采集從土壤表層到15cm處取樣200g，ー個地點采幾個樣本，混合過粗篩，取25g作分離用；(2)培養基平板制備將NA培養基(營養瓊脂培養基)和PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)培養基融化，分別倒入滅菌培養皿，冷卻，制成NA和PDA平板；
(3)稱取Ig 土樣于滅菌試管中，加IOOmL無菌水，振蕩，制成1(Γ2 土壤懸浮液，靜置5min，按10倍梯度稀釋到10_7 ；(4)取上述土壤懸浮液O. 5mL,加到培養基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養箱26 °C恒溫培養5-7d ；(5)將單個菌落在NA培養基上劃線，得到單菌落，轉移至NA試管斜面培養基中，至26 °C恒溫培養；(6)以黃瓜立枯病菌為祀標菌,米用對峙培養法,篩選到一株對黃瓜立枯病菌具有較強抑制活性的菌株，編號LLM-002。所述NA培養基配方為蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaC15g、瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL ;所述PDA培養基配方為馬鈴薯(去皮切塊)300g,葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL。2.菌株鑒定 (I)微生物學特性菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，兼性厭氧。NA培養基培養菌落圓形，白色，平展，表面粗糙，中間有圓環形突起，邊緣整齊。液體培養形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。其它特性見下表I :表I
試驗項目結果 -試驗項目結果
■Y(て氏染色陽性碳水物產K'
細*形狀桿狀+
細 fcf [徑>1μηι-Wft+ Π 糖ニ
形成還孢*木糖·+
硭*膨人け》醇=
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Hit ·丨《翁水解，
RHIUC—j明膠水_-
w y驗+利)-
VP !W液 pH > 7 —50Γ .1 ·: K-
VP 海液 pH <6 +7%NaCl I·； K」
WWSAk還>pH5,7 IUx*(2)分子生物學特性16S rRNA基因序列測定結果如下CGGCGGCTGGCTCATAMGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAMCTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACMGGCCCGGGMCGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGMCTGAGMCAGATTTGTGGGATTGGCTTMCCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATMGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCMCTGMTGCTGGCMCTMGATCMGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTMCCCMCATCTCACGACACGAGCTGACGACMCCATGCACCACCTGTCACTCTGCC
CCCGMGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCMGACCTGGTMGGTTCTTCGCGTTGCTTCGMTTAMCCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCMTTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTMTGCGTTAGCTGCAGCACTMGGGGCGGAMCCCCCTMCACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTMTCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTT
ACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGMTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCMGTTCCCCAGTTTCCMTGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTMGAMCCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCMTMTTCCGGACMCGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCMGGTGCCGCCCTATTTGMC GGCACTTGTTCTTCCCTMCMCAGAGCTTTACGATCCGAAMCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGMGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCMCTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTMGTGGTAGCCGMGCCACCTTTTATGTCTGMCCATGCGGTTCAMCMCCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCatpA基因序列測定結果如下GTTGGCCGGTGMCTTGTTGAGTTTTCAMCGGCGTTTTGGGTATGGCTCAAMCCTTGMGMTCCMCGTAGGTATCGTTATCTTAGGACCTTACAGAGATATCCGTGMGGTGATGAGGTCAAMGMCGGGCCGCATCATGGMGTTCCTGTAGGTGMGMTTMTCGGACGTATCGTCMCCCGCTCGGACAGCCGGTAGACGGACTGGGTCCGATTCTGACMGCAAMCACGTCCGATCGAMGCCAGGCTCCAGGCGTMTGGACCGTAMTCGGTACATGAGCCGCTGCAMCGGGTATCAMGCGATCGACGCGTTMTTCCGATCGGCCGCGGACAGCGTGAGCTGATTATCGGTGACCGTCAGACAGGTAAMCATCTGTTGCGATTGATACMTCTTAMCCAAAMGATCMGACATGATCTGTGTGTACGTAGCGATCGGCCAGAMGMTCTACAGTGCGCGGCGTAGTGGAMCACTTCGTMGCATGGCGCGCTTGATTACACGATTGTCGTGACGGCGTCCGCTTCACAGCCGGCTCCGCTTCTGTACCTTGCACCGTATGCAGGGGTGACMTGGGTGMGMTTCATGTACMCGGCMGCACGTTCTCGTCGTATATGATGATTT
ATCCAMCMGCGGCCGCTTACCGTGAGCTGTCATTGCTTCTTCGCCGTCCGCCGGGCCGTGMGCATTCCCTGGGGATGTATTCTATCTTCACTCCCGTCTGCTTGAGCGCGCAGCCMGCTGAGTGACGCAAMGGTGCAGGATCMTTACGGCGCTGCCGTTCGTCGAMCACMGCAGGAGATATCTCCGCTTATATCCCGACAMCGTCATTTCCATTACTGACGGACAGATTTTCCTTCMTCTGACCTATTCTTCTCAGGCGTGCGTCCTGCGATAMTGCCGGATTATCCGTTTCCCGTGTCGGCGGATCAGCCCAMTCAMGCGATGAAAMGGTAGCGGGMCATTGCGTCTTGACCTGGCTTCATACCGTGAACTTGAAGCGTTCGCCCAATTCGATC此菌株已于2011年07月08日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為 CGMCC No. 5043。實施例2解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043發酵液的制備(I)將保存的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043轉移至NA培養基試管斜面中，置于培養箱26°C恒溫培養2-3天。(2)在無菌條件下，將培養好的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043用無菌水稀釋，吸取lmL，接種于高壓蒸汽滅菌后的NB液體培養基(以重量百分含量計，豆粉I. 5%，玉米粉
I.6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，硫酸銨O. I %，硫酸鎂O. 01 %，磷酸ニ氫鉀O. 03 %，其余為水，pH7. 5。)中，裝量200ml/500ml三角瓶，28°C恒溫搖床振蕩培養I 2d得到種子液；(3)按O. 5%比例(體積比)將種子液接種到大量發酵培養基(以重量百分含量計，豆粉I. 8%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，魚粉O. 47%，硫酸鎂O. 01 %，磷酸ニ氫鉀
O.03%，其余為水，pH7. 5)中，培養溫度26°C，培養時間72小時，通風I :0. 8。發酵完成后，發酵液菌數可達45億個/g或以上。實施例3解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043的作用驗證本實施例提供了解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043 (以下簡稱為解淀粉芽孢桿菌LLM-002)發酵液針對黃瓜立枯病的相關實驗。I. I供試藥劑本發明實施例2制備的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) (LLM-002) CGMCC No. 5043發酵液；96%惡霉靈可濕性粉劑(市售)。I. 2供試作物與防治對象供試作物為黃瓜，品種為密刺；防治對象立枯病I. 3試驗地情況試驗地設在山東省壽光市蔬菜大棚，該大棚黃瓜立枯病近幾年發生嚴重，且防治困難，試驗在900平方米大棚內，土質為輕壤土，有機質含量為I. 01%, pH值為7. 7，所有試驗小區栽培條件及管理措施一致，施藥時黃瓜立枯病處于發病初期。I. 4試驗設計及安排本試驗設計了解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) (LLM-002)CGMCCNo. 5043發酵液10倍，96%惡霉靈可濕性粉劑3000倍液及不施藥清水作對照共3個處理，重復4次，共12個小區，各小區隨機排列，小區面積為33.4平方米。于2011年7月12日、7月19日和26日各灌根一次，畝用藥液500千克，噴藥器械為エ農-16型噴霧器，將噴頭取下噴灌。I. 5試驗調查及計算方法I. 5. I氣象條件第I次施藥(7月12日)當日少云，風カ3級，最高氣溫為32°C，最低氣溫為26°C，相対濕度為70%。第2次施藥(7月19日)，當日多云，風カ4級，最高氣溫為31°C，最低氣溫為24°C，相対濕度為75%;第3次施藥(7月26日)當日睛，風カ3級，最高氣溫為29°C，最低氣溫為25°C，相対濕度為85%。I. 5. 2藥效及安全性調查藥效調查第I次施藥后第7d和最后一次施藥后14d進行調查。每小區采用4點取樣法，每點查2株，調查全部葉片，調查發病率，記錄病情級數并計算病情指數。安全性調查于第一次施藥后7d和14d觀察黃瓜的安全性，如有藥害發生，詳細描述藥害癥狀并按藥害程度分級標準確定藥害程度。分級方法(以葉片為單位)O級健康苗I級莖基或根部稍現病斑或稍變色；2級1/3或1/2莖基或根部出現病斑或者變色腐爛；
3級全莖或根部被病斑環繞、變色、腐爛；4級黃瓜苗萎蔫枯死；1.5. 3調查時間和次數施藥前調查病情基數，下次施藥前及末次施藥后IOd調查防治結果。I. 5. 4藥效計算方法 藥效按式(I)、(2)計算
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Iv ('Klx ITO J式中AKtl——空白對照區施藥前病情指數；CK1——空白對照區施藥后病情指數；PT0——藥劑處理后施藥前病情指數；PT1——藥劑處理后施藥后病情指數；I. 5. 5對作物的直接影響觀察藥劑對作物有無藥害，記錄藥害的類型和程度。此外，也要記錄對作物的其他有益影響(例如促進成熟、刺激生長等)。用下列方式記錄藥害(a)如果藥害能被測量或計算，要用絕對值表示，例如株高、結實率。(b)在其他情況下，可以按下列兩種方法估計藥害程度和頻率( I)按照藥害分級方法記錄姆小區的藥害程度，以一、+、+ +、+ + +、+ + + +表不。藥害分級方法—:無藥害；+ :輕度藥害，不影響作物生長；++:中度藥害，可復原，不會造成作物減產；+ + + :中度藥害，影響作物正常生長，對作產量和質量造成一定程度的損失；+ + + + :嚴重藥害，作物生長受阻，產量和質量損失嚴重。(2)將藥劑處理區與空白對照區比較，評價其藥害百分率。同時，要準確描述作物的藥害癥狀(矮化、褪綠、畸形等)2.結果2. I供試藥劑對黃瓜立枯病的防治效果表2 結果顯不，解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) (LLM-002)CGMCCNo. 5043發酵液及96%惡霉靈可濕性粉劑對黃瓜立枯病有較好的防治效果，一次用藥7d防治效果均達到60%以上，其中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) (LLM-002)CGMCC No. 5043防治效果最好。從黃瓜立枯病田間試驗的病情指數來看(表2)，一次用藥7d，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) (LLM-002)CGMCC No. 5043 防治效果為 79. 22%，明顯高于96%惡霉靈可濕性粉劑的防治效果。表2各處理防治黃瓜立枯病試驗效果調查原始數據0184]
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌的保藏編號為CGMCCNo.5043。
2.一種解淀粉芽孢桿菌的發酵液，其特征在于，所述發酵液每毫升發包含45億個/ml或以上的根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043 ； 所述發酵液通過包括以下步驟的方法制得 將根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043在NB液體培養基培養得到種子液，然后將所述種子液接種到大量發酵培養基中發酵培養；其中所述NB液體培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 5%，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，硫酸銨O. I %，硫酸鎂O. 01%，磷酸二氫鉀O. 03%，其余為水，pH7. 5 ;所述大量發酵培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 8%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，魚粉O. 47%，硫酸鎂O. 01 %，磷酸二氫鉀O. 03%，其余為水，ρΗ7· 5 ； 進一步優選地，所述發酵液通過包括以下步驟的方法制得 (1)將根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043接種至NA培養基試管斜面中，在26°C -28°C下恒溫培養2-3天； (2)在無菌條件下，將培養好的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043試管斜面菌種用無菌水稀釋，吸取稀釋菌液lmL，接種于高壓蒸汽滅菌后的NB液體培養基中，裝量200ml/500ml三角瓶，28°C下恒溫搖床振蕩培養f 2d，從而得到種子液； (3)按O.5%的接種比例將種子液接種到大量發酵培養基中，26°C — 28°C下培養72小時，通風I :0. 8。
3.根據權利要求2所述的發酵液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟 將根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌CGMCC No. 5043在NB液體培養基培養得到種子液，然后將所述種子液接種到大量發酵培養基中發酵培養； 其中所述NB液體培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 5%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，硫酸銨O. I %，硫酸鎂O. 01 %，磷酸二氫鉀O. 03%,其余為水，pH7. 5 ;所述大量發酵培養基包含以重量百分含量計，豆粉I. 8%，玉米粉I. 6%，淀粉和碳酸鈣各O. 44%，魚粉O. 47%，硫酸鎂O. 01%，磷酸二氫鉀O. 03%，其余為水，ρΗ7· 5。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟 (1)將根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043接種至NA培養基試管斜面中，在26°C -28°C下恒溫培養2-3天； (2)在無菌條件下，將培養好的解淀粉芽孢桿菌CGMCCNo. 5043試管斜面菌種用無菌水稀釋，吸取稀釋菌液lmL，接種于高壓蒸汽滅菌后的NB液體培養基中，裝量200ml/500ml三角瓶，28°C下振蕩培養Γ2天，從而得到種子液； (3)按O.5%的接種比例將種子液接種到大量發酵培養基中，26°C — 28°C下培養72小時，通風I :0. 8。
5.—種解淀粉芽孢桿菌的菌劑，其特征在于，所述菌劑包含根據權利要求2所述的發酵液； 優選地，所述菌劑還包含輔助基質，所述輔助基質選自微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或兩種。
6.根據權利要求5所述的菌劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將根據權利要求2所述的發酵液與輔助基質混合的步驟。
7.根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌或者根據權利要求2所述的發酵液或者根據權利要求5所述的菌劑在制備生物肥料和/或用于防治植物病害的生物農藥中的用途。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于，所述植物病害選自真菌病害； 優選地，所述植物病害選自根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病和炭疽病中的一種或多種，優選立枯病。
9.一種用于防治植物病害的方法，其特征在于，所述方法包括向具有病害的植物施用根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌或者根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌發酵液或者根據權利要求4所述的解淀粉芽孢桿菌菌劑； 優選地，所述植物病害選自真菌病害，進一步優選根腐病、青霉病、霜霉病、疫病、立枯病、灰霉病和炭疽病中的一種或多種，更優選立枯病。
10.一種用于促進植物生長的方法，其特征在于，所述方法包括向植物施用根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌或者根據權利要求2所述的發酵液或者根據權利要求4所述的菌劑。
全文摘要
本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌及其應用。本發明提供的解淀粉芽孢桿菌的保藏編號為CGMCC No.5043，其發酵液及制得的菌劑可以用于防治植物病害，同時具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少抗生素藥物的使用，增強免疫力的優點。
文檔編號C05F11/08GK102864100SQ20121029346
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者湯潔 申請人:北京雷力農用化學有限公司