專利名稱：一種花生離體誘變定向篩選抗性體的方法
技術領域：
本發明屬于花生育種領域，尤其涉及一種花生離體誘變定向篩選抗性體的方法。
背景技術：
隨著環境的不斷惡化，干旱、鹽堿等逆境脅迫已成為世界性的問題，培育多種抗逆性的作物新品種已成為廣大育種家的主要育種目標之一。花生是我國重要的油料作物和經濟作物之一，然而花生栽培種中缺乏高抗性品種資源，抗逆品種的選育一直是一個難以解決的問題。誘變技術的利用能夠產生自然界不存在的新性狀、新類型，利用誘變與組織培養相結合進行定向篩選突變體，能節省人力、物力、財力，縮短育種年限。因此，離體誘變與組織培養結合是獲得新種質的有效手段。利用誘變與植物組織培養相結合創造新的種質資源研究已在多種植物上進行，在抗病性、抗逆性、熟性、產量、品質等方面獲得了各種各樣的優良突變體，有的突變體直接應用或作為親本材料育成了新品種。近年來，極少數報道有關花生離體誘變研究，但離體誘變 定向篩選抗逆突變體目前未見報道。

發明內容
本發明提供了一種花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，本發明通過離體誘變進行定向篩選抗性體，可以創造花生抗逆新種質，克服花生遺傳基礎狹窄、缺乏高抗性品種資源，致使花生抗逆育種難以獲得突破性進展的困難，并可節省大量人力、物力、財力，縮短育種年限。為達到解決上述問題的目的，本發明采用以下技術方案予以實現
一種花生離體誘變定向篩選抗性體的方法，它包括如下步驟
(1)將成熟花生種子去子葉后的種胚進行表面消毒；
(2)在無菌條件下分離所述種胚的胚小葉為外植體，將胚小葉接種到體胚誘導培養基中，進行誘變培養25 30d，少部分外植體形成體胚；所述體胚誘導培養基以MSB5為基本培養基，并添加3 4mg/L平陽霉素和5 10mg/L 2, 4-D ；
(3)將形成體胚的外植體轉移至體胚萌發培養基上進行培養得到抗性再生苗，所述體胚萌發培養基以MSB5為基本培養基，并添加4 8mg/L羥脯氨酸和4mg/L BAP ；
(4)當抗性再生苗生長至2 3cm時，從基部切下，嫁接于無菌萌發的花生實生苗的胚軸上，無菌培養Hd后,移栽于育苗基質中馴化培養,后移栽到田間培養。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(3)中采用加篩選壓和不加篩選壓各培養4w進行交替培養。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(3)中體胚萌發階段的羥脯氨酸抗逆篩選濃度為4mg/L，繼代培養時羥脯氨酸抗逆篩選濃度為8mg/L。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(I)中花生種胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 1%的升汞浸泡,然后用無菌水漂洗后,置于無菌水中浸泡12 16h0對上述技術方案的進一步改進所述步驟(2)和(3)中培養條件為溫度為24 26°C、光照強度為2000 3000Lx、光照時間為10_15h/d，培養基的調至pH 5. 8。對上述技術方案的進一步改進所述體胚誘導培養基為MSB5+5 mg/L 2，4_D+3mg/L PYM +30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述體胚萌發培養基為MSB5+4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂+4mg/L羥脯氨酸。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(4)中以苗齡9-12d的花生無菌苗為砧木，抗性再生苗為接穗進行無菌嫁接。對上述技術方案的進一步改進所述馴化培養的條件為22 26°C，馴化室培養18 25d。 本發明的優點和積極效果是
I、本發明以花生成熟種子胚的胚小葉為外植體，在基本培養基中添加3 4mg/L平陽霉素和5 10mg/L 2,4-D (氯化苯氧乙酸類除草劑)進行誘變處理。形成體胚的外植體，再轉移到添加4 8mg/L羥脯氨酸和4mg BAP (6-芐氨基嘌呤)的培養基上促使體胚萌發成苗，同時進行定向篩選抗性體。本發明以羥脯氨酸(HYP)作為抗逆篩選壓力添加于培養基中，對各培養階段適宜的篩選濃度進行了研究，并獲得了抗性體。獲得的羥脯氨酸抗性苗經嫁接馴化后移栽田間，獲得的成熟種子次年播種田間，與誘變親本相比，大部分抗性苗后代植株發生明顯變異和分離，并與誘變親本相比表現出明顯的差異；干旱處理條件下與誘變親本相比，抗性體表現出明顯的抗旱性，且SOD (超氧化物歧化酶)活性和POD (過氧化物酶)活性明顯升高。2、本發明以花生成熟種子作為誘變材料可不受季節限制，常年可以進行誘變處理和定向篩選。3、利用離體誘變結合組織培養定向篩選抗逆突變體，篩選過程于培養基中進行，大量不具有抗逆性的培養材料被淘汰，可節省大量的人力、物力、財力；突變體的再生通過胚胎發生途徑，體細胞胚起源于一個細胞，可避免突變體的嵌合性。本發明為開拓花生新的育種途徑奠定了基礎，獲得的抗旱抗性體可直接或間接用于花生育種。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
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圖I表明在未添加HYP的誘導培養基上花生胚小葉形成正常體胚。圖2表明不同濃度HYP對花生胚小葉生長的影響，A:添加2 mg/L HYP的體胚誘導培養基添加4 mg/L HYP的體胚誘導培養基；C:添加6mg/L HYP的體胚誘導培養基；D:添加8 mg/L HYP的體胚誘導培養基。圖3表明本發明中HYP對體胚萌發的影響，A :未添加HYP的體胚萌發培養基；B 添加4 mg/L HYP的體胚萌發培養基；C:添加8 mg/L HYP的體胚萌發培養基。圖4表明本發明中繼代培養時HYP對體胚萌發成苗的影響，A :未添加HYP的體胚萌發培養基:添加8 mg/L HYP的體胚萌發培養基。
圖5是本發明中花育20號胚小葉離體誘變、定向篩選及抗性苗結實；A :在添加3mg/L PYM的誘導培養基上形成的體胚；B :先后在添加4mg/L HYP和8mg/L HYP的體胚萌發培養基上篩選獲得的抗性小苗；C :表現變異的抗性苗；D :抗性苗結實。圖6是本發明中誘變親本和突變體M2代表型及其分離情況;A :誘變親本花育20號；B :43號株系株高 變矮；C :42號株系莖枝顏色、株型、開花習性發生變異；D :33號株系株高明顯分離。圖7是本發明中干旱處理后，誘變親本及突變體M2代的生長狀況;A :誘變親本花育20號；B Al號株系；C :42號株系。圖8是本發明中耐HYP抗性體M2代的SOD活性。圖9是本發明中耐HYP抗性體M2代的POD活性。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I
本發明所述花生離體誘變定向篩選抗性體的方法，包括如下步驟
I.培養基的制備
(I)制備誘變及體胚誘導培養基選取MSB5 (MS無機鹽+ B5有機成分)為基本培養基，在此MSB5培養基中添加平陽霉素和2，4-D形成誘變及體胚誘導培養基。平陽霉素的添加量為3 4mg/L，2，4-D的添加量為5 10mg/L。本實施例中體胚誘導培養基為MSB5+5 mg/L2，4-D+3 mg/L平陽霉素+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；將所述體胚誘導培養基的pH調至5. 8，在培養室溫度為24 26°C、光照強度為2500 3000Lx、每日光照為10 15h的條件下進行培養。誘變和體胚誘導同時進行。平陽霉素(PYM)是一種抗生素，屬于博萊霉素的一類，是博萊霉素的A5組分，它作為誘變劑具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點。2，4-D是一種氯化苯氧乙酸類除草齊U，也可用作植物生長調節，是用于誘導愈傷組織形成的常用生長素，在本發明中用來誘導體胚形成。(2)制備抗逆篩選及體胚萌發培養基選取MSB5 (MS無機鹽+ B5有機成分)為基本培養基，在此MSB5培養基中添加羥脯氨酸(HYP)和6-芐氨基嘌呤(BAP)形成抗逆定向篩選及體胚萌發培養基，羥脯氨酸的添加量為4 8mg/L，BAP的添加量為4mg/L。本實施例中體胚萌發培養基為MSB5+4 8mg/L HYP +4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，將所述體胚萌發培養基的PH調至5. 8，在培養室溫度為24 26°C、光照強度為2500 3000Lx、每日光照為10 15h的條件下進行培養。定向篩選和體胚萌發同時進行。2. HYP篩選濃度的確定
以HYP作為抗逆篩選壓力添加于培養基中進行定向篩選抗性體。首先確立適宜的HYP臨界濃度，試驗分別在培養的3個不同時期進行處理I，誘導培養基中添加0，2，4，6，8 mg/L HYP ;處理II，在未添加HYP的誘導培養基上形成的體胚叢轉移到體胚萌發培養基上培養，體胚萌發培養基中添加0，4，6，8，10 mg/L HYP ;處理III，前2個培養均未添加HYP的培養基上獲得的萌發體胚叢，轉移到新鮮的體胚萌發培養基上進行繼代培養，培養基中添加8，10，12 mg/L HYP。每個階段分別培養4w后觀察試驗結果。
花生各個生長發育時期對逆境的耐受性不同。同理，組織培養條件下各階段對逆境脅迫的耐受程度亦不同。以HYP模擬逆境條件，添加于培養基中進行定向篩選抗性體，研究了花生胚小葉 組織培養通過體細胞胚胎發生途徑再生植株的三個不同階段中HYP的最佳篩選濃度。處理I，將胚小葉接種在添加不同濃度HYP (0,2,4,6,8 mg/L)的誘導培養基上，培養4w后的結果如圖I和2所示，從圖中可以看出，HYP嚴重抑制體胚的形成，除對照(圖I所示)外，在上述添加不同濃度HYP的誘導培養基上，無論HYP濃度高低(圖2A、B、C和D所示)，胚小葉外植體均形成疏松的愈傷組織或褐化，所有培養基上均未觀察到體胚的形成。因此判斷，體胚誘導階段不適于定向篩選。處理II，在未添加HYP的誘導培養基上培養4w后形成體胚的外植體，轉移到添加HYP(0，4，6，8，10 mg/L)的體胚萌發培養基上進行培養。培養4w后實驗結果如圖3所示，從圖3中可以看出，在未添加HYP的體胚萌發培養基上(圖3A)，體胚萌發正常；在添加4 mg/L HYP的體胚萌發培養基上(圖3B)，體胚雖沒有完全致死，但是已嚴重抑制其生長；在添加8 mg/L HYP的體胚萌發培養基上(圖3C)體胚完全褐化死亡。因此，以4 mg/L HYP作為此培養階段的抗逆篩選濃度。處理III，在前2個處理階段均不進行抗逆篩選，而進行正常的培養。胚小葉外植體在誘導培養基上培養4w后形成體胚叢，將體胚叢轉移到體胚萌發培養基上再培養4w，大部分體胚萌發。然后將萌發的體胚叢轉移到新鮮的培養基上進行繼代培養，培養基中添加0，8，10，12 mg/L HYP。4w后實驗結果如圖4所示，從圖4中可以看出，在未添加HYP的培養基上(圖4A所示)，體胚萌發長成的小苗生長正常；在添加8 mg/L HYP的培養基上(圖4B所示)，由體胚萌發長成的小苗生長受到抑制。因此，此階段HYP抗旱篩選濃度確定為8 mg/L。3.平陽霉素誘變處理
以花育20號種子胚小葉為誘變培養材料，以平陽霉素(PYM)作為誘變劑，添加于培養基中進行誘變處理。選取飽滿的花育20號種子去子葉，將種胚置于75%的酒精浸泡20s，再用
0.1%的升汞浸泡lOmin，進行表面消毒，用無菌水漂洗5次后，置于裝有無菌水的廣口瓶中浸泡12 16h。取出浸泡的種胚,置于無菌培養皿中分離胚小葉,然后接種到添加3mg/LPYM的誘導培養基上培養4w，進行誘變處理及誘導體胚的形成。4. HYP抗性苗的定向篩選
花育20號種子胚小葉培養在添加3mg/L PYM的誘導培養基上進行誘變處理。培養IOd后，外植體開始形成乳白色愈傷組織，培養4w，部分愈傷組織逐漸褐化或者形成玻璃化愈傷組織，另有部分能夠形成體胚，如圖5 A所示。誘變培養4w后，將形成體胚的外植體轉移到體胚萌發培養基上促使體胚萌發，并進行定向篩選抗性體。利用上述確定的HYP篩選濃度,進行胚小葉外植體誘變處理和定向篩選抗性體。首先在體胚萌發培養基中添加4 mg/L HYP，繼代培養時增加到8 mg/L。為避免篩選的培養材料生長過慢或褐變，在體胚萌發培養基上篩選時，采用加篩選壓和不加篩選壓各培養4w進行交替培養。在含有HYP的培養基上培養4w后，大部分外植體及體胚死亡，僅有少數存活；幸存的形成體胚的外植體轉到不含篩選壓的體胚萌發培養基上，慢慢恢復生長，接觸培養基的部分形成大量綠色致密的愈傷組織，4w后再轉至篩選培養基上，如此循環反復，直至出苗(圖5 B)。最終獲得了少量花育20號抗性苗。5.抗HYP再生苗的嫁接與移栽
以上述篩選獲得的花育20號再生苗為接穗、花育23號的無菌苗為砧木，在超凈臺內參照郝世俊等[郝世俊等，花生組培苗嫁接技術的研究[J].青島農業大學學報，27(2) :110-113]的方法進行無菌嫁接、馴化移栽及管理。2011年進行抗性苗的嫁接，經馴化后移栽于青島農業大學試驗田，生長發育階段進行觀察和記載，成熟后分單株收獲莢果。2012年將單株收獲的種子，部分按株系(M2代)種于塑料大棚進行干旱處理；其余部分按株系(M2代)播種于青島農業大學試驗田，苗期及生長發育階段觀察記載性狀變異及分離情況。當HYP抗性再生苗生長至2cm時，便可以進行無菌嫁接。以苗齡約IOd的花育23號無菌苗為砧木，抗性再生苗為接穗進行無菌嫁接。嫁接苗經馴化后移栽于試驗田，觀察發現，42號再生苗當代即表現出變異，莖枝顏色變為紫色(圖5 C)，而誘變親本為綠色。嫁接苗按常規進行田間管理，成熟后按單株收獲莢果，共有13株抗性苗得到了仏代種子(圖5 D)。6.抗性苗M2代分離和變異情況
將收獲的M2代種子，次年部分種子按株系播種于大田，以誘變親本花育20號作對照。生長發育階段觀察結果顯示，13個株系(3廣43號)中，除32號無明顯變異外，其他12個株系在株高、莖枝顏色、株型、開花習性等方面與誘變親本不同，表現出明顯變異，并且觀察到大部分株系發生明顯分離。31號、39號、40號、41號、43號株系整體明顯變矮(圖6 B) ；38號株系其中I株變矮，分枝數增多；42號株系大部分植株莖枝變成紫色、半匍匐型、分枝數明顯增多成為密枝型、交替開花(圖6 C)，同株系的其他少部分植株矮小，而誘變親本花育22號莖枝綠色，株型直立，疏枝，連續開花(圖6 A);其他株系也均發生了變異和分離(圖6D)。 7.抗性體的抗旱性鑒定
將7個單株(33號、34號、35號、37號、41號、42號、43號)收獲的M2代的部分種子按株系播種于塑料大棚，以誘變親本花育20號作對照。苗期進行干旱處理后，大部分抗性植株后代生長正常；而花育20號生長明顯受抑制，棵較小，部分葉片枯黃(圖7)。所述干旱處理的方法為將種子播種于塑料大棚，播種時澆足水，之后I個半月未澆水，進行干旱處理(SOD、POD測定取材是此時取的葉片材料)。8.抗性體的生理生化指標的測定 8. I粗酶提取
取塑料大棚進行干旱處理后的植株(M2代)葉片，稱取鮮葉樣品0. 5g于預冷的研缽中，加入少量的PVP和二氧化硅，加Iml 0. 05mol/L的磷酸緩沖液(pH7. 8)在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使最終體積為5ml。將提取液于10000轉/分冷凍離心20min，上清液4°C保
存備用。8. 2超氧化物歧化酶(SOD )活性的測定
參照植物生理實驗技術測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以抑制NBT光化還原的50%為I個酶單位。SOD 總活性(U/g) =[(Ack — AE) XV]/(0. 5AckXWXVt)
Ack為照光對照管的吸光度值；AE為樣品管的吸光度值；V為樣品液總體積(ml) ；ff為樣品鮮重；vt為測定時樣品用量。結果如圖8所不，從圖8可以看出，測試的7個株系中33號、34號、35號、41號、42號5個株系的SOD活性高于誘變親本花育20號，特別33、34、35號SOD活性明顯升高，是親本的2-3倍。37號株系與親本基本相同，43號株系明顯低于親本。8. 3過氧化物酶(POD )活性的測定
參照張志良法測定過氧化物酶(POD)活性，記錄5min內愈木酚被氧化的速率，以每分鐘吸光度A470變化0. 01為I個過氧化物酶活性單位(U)，按下式計算POD活性卩00活性(。/&.111111))=(八六470\￥0 / (WXVsX0. OlXt)
AA470為反應時間內吸光度的變化；Vt為提取液總體積(ml);W為樣品鮮重(g);Vs為測定時取用酶液體積(ml) ；t為反應時間(min)。
結果如圖9所示，由圖9看出，測試的7個株系中，33號、34號、35號、41號4個株系的POD活性較誘變親本花育20號POD活性高。由圖4和圖5還可以說明，SOD活性和POD 活性測定結果比較一致，SOD活性高于親本的33號、34號、35號、41號、42號中，僅有42號POD活性低于對照，其他4個株系POD活性均高于親本。而43號株系SOD活性和POD活性在測試的材料中均最低，均明顯低于親本。PYM是一種抗生素，作為一種新的誘變劑，被證明具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點，具有廣闊的開發和應用前景。本發明利用PYM作為誘變劑，獲得的HYP抗性苗經嫁接移栽田間，13株獲得種子。次年按株系播種于大田，12個株系發生變異和分離。結果進一步證實了 PYM的誘變效果。POD可以清除生物體內氧自由基，避免組織細胞受到傷害，在生物抗逆境脅迫、抗衰老中起很重要的作用。POD在細胞內含量的升高證明細胞在逆境中的活力越強。SOD的主要功能也是清除生物體內超氧離子基團，防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜的傷害。姜慧芳等在花生干旱脅迫下測定SOD活性，結果表明，抗旱品種的SOD活性升高較多；而敏感品種的SOD活性升高較少。本研究中離體誘變獲得的HYP抗性植株經嫁接移栽田間后，7個單株收獲的M2代的部分種子，次年按株系播種于塑料大棚，苗期進行干旱處理后，大部分抗性植株后代生長正常；而誘變親本花育20號生長明顯受抑制。SOD活性和POD活性測定結果表明，大部分株系SOD活性和POD活性明顯高于誘變親本，說明獲得的這些抗性苗為抗逆突變體。脯氨酸作為滲透調節物質在耐鹽、抗旱生理中具有重要作用。以脯氨酸類似物-羥脯氨酸(HYP)作為選擇壓力，通過組織培養手段，已先后在許多作物上獲得耐HYP的變異細胞系，并表現出較強的抗逆性。本研究將HYP添加于花生體胚萌發培養基中進行定向篩選，最終獲得了抗旱突變體，進一步說明HYP作為篩選壓力添加于培養基中定向篩選抗逆突變體是有效的。定向篩選可節省人力、物力、財力。本發明利用安全、高效的PYM作為誘變劑進行花生離體誘變，以HYP作為篩選壓力，獲得的抗性再生苗經嫁接移栽田間，13個植株獲得了成熟種子。次年按株系播種，其中12個株系發生變異和分離，說明基因發生了突變；7個株系進行干旱處理后，大部分植株表現生長正常，而誘變親本生長明顯受抑制，7個株系中5個株系SOD活性高于誘變親本，其中4個株系POD活性也高于誘變親本，證實這些突變體具有較強的抗旱能力。這些突變體的耐鹽性、耐冷性有待于進一步研究。
權利要求
1.一種花生離體誘變定向篩選抗性體的方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)將成熟花生種子去子葉后的種胚進行表面消毒； (2)在無菌條件下分離所述種胚的胚小葉為外植體，將胚小葉接種到體胚誘導培養基中，進行誘變培養25 30d，少部分外植體形成體胚；所述體胚誘導培養基以MSB5為基本培養基，并添加3 4mg/L平陽霉素和5 10mg/L 2, 4-D ； (3)將形成體胚的外植體轉移至體胚萌發培養基上培養，進行定向抗逆篩選得到抗性再生苗，所述體胚萌發培養基以MSB5為基本培養基，并添加4 8mg/L羥脯氨酸和4mg/LBAP ； (4)當抗性再生苗生長至2 3cm時，從基部切下，嫁接于無菌萌發的花生實生苗的胚軸上，無菌培養l-2d后，移栽于育苗基質中馴化培養，后移栽到田間。
2.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所 述步驟(3)中采用加篩選壓和不加篩選壓各培養4w進行交替培養。
3.根據權利要求2所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述步驟(3)中體胚萌發階段的羥脯氨酸抗逆篩選濃度為4mg/L，繼代培養時羥脯氨酸抗逆篩選濃度為8mg/L。
4.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述步驟(I)中花生種胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15 25s，再用O. 1%的升汞浸泡，然后用無菌水漂洗后，置于無菌水中浸泡12 16h。
5.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述步驟(2)和(3)中培養條件為溫度為24 26°C、光照強度為2000 3000Lx、光照時間為10-15h/d，培養基的調至pH 5.8。
6.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述體胚誘導培養基為MSB5+5 mg/L 2，4-D+3mg/L PYM +30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述體胚萌發培養基為MSB5+4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂+4mg/L羥脯氨酸。
7.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述步驟(4)中以苗齡9-12d的花生無菌苗為砧木，抗性再生苗為接穗進行無菌嫁接。
8.根據權利要求I所述的花生離體誘變定向篩選抗逆突變體的方法，其特征在于所述馴化培養的條件為22 26°C，馴化室培養18 25d。
全文摘要
本發明提供了一種花生離體誘變定向篩選抗性體的方法，主要步驟是將花生種胚表面消毒并用無菌水漂洗后浸泡；分離胚小葉，接種到體胚誘導培養基中誘變培養；將形成體胚的外植體轉移到體胚萌發培養基上，以羥脯氨酸作為篩選壓力添加于培養基中，進行定向篩選抗性體，獲得的抗性苗經嫁接移栽田間，常規田間管理。本發明獲得的抗性體大部分后代植株發生明顯變異和分離；抗旱性明顯，且SOD酶活性和POD酶活性明顯升高；本發明的誘變材料可不受季節限制；利用離體誘變結合組織培養定向篩選抗逆突變體，可節省大量的人力、物力、財力；突變體的再生通過胚胎發生途徑，體細胞胚起源于一個細胞，可避免突變體的嵌合性。
文檔編號A01H4/00GK102792892SQ201210297938
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者王晶珊, 趙明霞, 隋炯明, 喬利仙, 孫世孟, 郭寶太 申請人:青島農業大學