專利名稱：冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法
技術領域：
本發明涉及一種多倍體魚類雄核發育的方法，尤其是一種無需卵子失活及不經染色體加倍處理，可快速、高效生產雄核發育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法。
背景技術：
雄核發育(Androgenesis)是指用精子生產只帶父系遺傳物質個體的繁殖方式。由于雄核發育的遺傳物質完全來自父方，沒有雌性原核的參與，可用于純系的建立，同時可冷藏瀕危物種的精子，對物種的保護具有特殊的意義。另外，在水產養殖上，由于很多重要經濟魚類不同性別往往表現出不同的生產性能，如體型和體色的差異，生長速度的快慢，性成熟時間的不同等。所以，通過雄核發育控制魚類的性別，選擇具有最佳生長性能的雄性進行單性養殖，具有極為重要的應用價值。 目前，人工誘導魚類雄核發育的方法有兩種一種是用正常精子使經過遺傳失活的卵受精，得到雄核發育單倍體胚胎(η)，然后通過抑制第I次卵裂的發生誘導核內有絲分裂，由此使單倍體胚胎的染色體加倍發育成為純合二倍體個體。另一種方法是用四倍體個體的精子(2η)使遺傳失活的卵子“受精”，可以直接得到正常發育的二倍體雄核發育后代。即按照上述兩種方法獲得魚類雄核發育后代，必需解決卵子染色體遺傳失活或染色體加倍的問題。現有使卵子染色體遺傳失活最常用的方法有電離輻射或紫外線(UV)照射等，應用輻射的方法對卵子的遺傳物質進行滅活雖然簡便易行，但是射線在破壞卵子細胞核的同時，對細胞質和其它細胞器也造成不同程度的破壞，此卵子受精后，單倍體雖能較好地通過胚胎發育，但到孵化期或孵化后數天，就會因“單倍體綜合癥”而陸續死亡。現有染色體加倍的主要方法為利用溫度、壓力刺激或化學誘變劑阻止第一次卵裂，但是，所獲得二倍體的存活率極低。

發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種無需卵子失活及不經染色體加倍處理，可快速、高效生產雄核發育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法。本發明的技術解決方案是一種冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法，其特征在于依次按如下步驟進行
a.取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進行催產，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用；
b.將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進行孵化。本發明是取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子形成受精卵，用冷休克處理(3°C冰水，浸泡60min)，受精卵即可快速、高效生產雄核發育二倍體泥鰍，無需卵子遺傳失活及染色體加倍處理，避免了繁瑣的操作程序，廉價、易操作，縮短了獲得純系泥鰍育種時間，解決了現有理化誘導對受精卵造成傷害的問題，提高了雄核發育二倍體泥鰍孵化率和成活率，有利于大規模生產使用。


圖I是本發明實施例所制備的雄核發育二倍體泥鰍染色體(2n=50)的圖片。圖2是對照組(2n早X 4n ￠)泥鰍染色體(3n=75)的圖片。
具體實施例方式實施例依次按如下步驟進行
a.取發育良好的天然雄性四倍體泥鰍(4n=100)及雌性二倍體泥鰍(2n=50)，用現有技術的催產方法進行催產，水溫24± I °C,效應時間1(Γ 2小時后，確認排卵后，輕壓腹部采集雌性二倍體泥鰍的卵子，并用毛細管采集雄性四倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用；Kurokura’ s solution溶液的配制方法是現有技術，即 NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHCO3 20 mg, KCl 20 mg 溶于 100 ml 蒸餾水中；
b.按現有技術的方法將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，與現有技術所不同的是將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進行孵化。孵化時按照現有技術的孵化方法經常更換曝氣的水，保持室內空氣新鮮和流通，及時用吸管吸出死卵,孵化出的魚苗放入水槽中飼養。實驗
I.倍性檢測
通過早期混合胚胎制片法對本發明實施例及對照組的泥鰍體細胞染色體數目進行檢測，對照組與本發明實施例的區別是受精卵未經冷休克處理。早期混合胚胎制片法為取本發明實施例及對照組發育眼胞期的胚胎3(Γ50個，用鑷子剖去卵膜和卵黃后放入盛有0. 0025%的秋水仙素中處理45min，0. 8%的檸檬酸低滲20min,再用預冷的卡諾固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)固定3次，每次15 201^11，最后_20°C冷凍過夜。冷滴片，10%吉姆薩染色，鏡檢，拍照。本發明實施例照片如圖I所示結果表明雄核發育泥鰍染色體為二倍體(2n=50)。對照組照片如圖2所示結果表明染色體為三倍體(3n=75)。
權利要求
1.一種冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法，其特征在于依次按如下步驟進行 a.取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進行催產，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用； b.將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進行孵化。
全文摘要
本發明公開一種無需卵子失活及不經染色體加倍處理，可快速、高效生產雄核發育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導天然四倍體泥鰍雄核發育的方法，依次按如下步驟進行取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進行催產，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ssolution溶液100倍稀釋待用；將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3℃冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進行孵化。
文檔編號A01K61/00GK102835338SQ20121034526
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者李雅娟, 姜志強, 王玉生, 高養春, 劉博 申請人:大連海洋大學, 李雅娟