專利名稱：轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸b含量的方法
技術領域：
本發明屬于藥用植物基因工程技術領域，具體涉及到在丹參中組合共轉化金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因同時提高丹參中酚酸類成分迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。
背景技術：
丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生草本植物，以其根及根莖入藥，為我國常用大宗藥材之一。丹參的主要活性成分為脂溶性的丹參酮 類和水溶性的酚酸類，具有活血化瘀，通經止痛，清心除煩等功效，在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病、癌癥以及各種炎癥的治療。伴隨著丹參原藥材需求量的日益擴大和規范化種植的需求，培育活性成分含量高的優良丹參新品種已成為丹參原藥材生產中亟待解決的關鍵問題之一?；趥鹘y中藥多用其水煎劑的用藥方式，以迷迭香酸和丹酚酸B為代表的水溶性酚酸類成分被普遍認為是丹參發揮藥效的主要活性物質基礎，更是受到研究者的普遍關注。丹參水溶性酚酸類成分主要表現為抗氧化作用，迷迭香酸作為抗炎鎮痛藥已于1990年在德國投放市場；丹參素和原兒茶醛是丹參治療冠心病的主要有效成分；丹酚酸B是目前已知抗氧化作用最強的天然產物之一，也是丹參中含量最高、抗氧化活性最強的化合物，為2010年版《中華人民共和國藥典》規定的丹參藥材質量控制的水溶性指標性成分之一，對心、腦、肝、腎、胃等多個器官具有保護作用。隨著丹參有效成分及其藥理活性的深入研究，近年來以丹參為主要原料的藥品、制劑、化妝品和系列保健產品層出不窮，丹參資源供不應求。伴隨著丹參藥材需求的日益擴大和野生資源的逐漸減少，人工種植面積逐年增大。然而作為常異交植物，丹參種內變異較大，性狀復雜。栽培丹參只種不選的狀況使得各產地丹參質量參差不齊，品種退化嚴重，有效成分含量不穩定，成為丹參作為高品質植物藥大規模進軍國際市場的最大障礙之一。另夕卜，由于人工栽培條件下藥田生態環境中生物多樣性差、豐富度低，導致丹參病蟲害優勢種群突出、病蟲害頻發，嚴重影響了藥材的產量和質量。上述問題成為中藥丹參藥材產業發展的瓶頸。由于丹參野生資源幾乎耗盡，目前藥用丹參以人工栽培為主，而栽培中人們對丹參優良品種的選育重視不夠，導致丹參質量良莠差異較大。因此，提高丹參中有效成分，尤其是迷迭香酸和丹酚酸B的含量，培育優異的丹參資源具有重要意義。為了提高品質、滿足市場需求，近年來利用基因工程、細胞工程等現代生物技術手段對丹參進行改良以提高其藥材有效成分的含量愈來愈受到人們的重視。在諸多方法之中，利用基因工程技術對藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造，提高藥用植物有效成分含量，培育能夠大量積累目標次生代謝物的新品種，愈來愈受到人們的關注。以轉基因技術為核心的現代分子育種技術在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培養高天然藥物含量的新型轉基因藥材中有著誘人的應用前景。但目前利用轉基因技術提高丹參中丹參酚酸類成分的含量，特別是迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法尚無報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服上述技術的不足，提供一種轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法。解決上述技術問題所采用的技術方案是它包括下述步驟I、金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因的克隆
提取金魚草總RNA并反轉錄成cDNA備用，采用Primer Premier 5. O軟件,設計金魚草DeIiIa和Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在金魚草DeIiIa基因的上游弓丨物前引入BamH I限制性酶切位點和保護堿基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位點和保護堿某CAGGAGCTC,金隹草Delila某閔h游引物序列為Delila-F :5，-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3，，下游引物序列為 De I i Ia_R : 5 ’ -CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’;在金魚草Roseal基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位點和保護堿基GAAGATCT,在下游引物前弓I入BstEII限制性酶切位點和保護堿基CAGGGTAACC,金魚草 Roseal 基因的上游引物為 Roseal-F :5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3，,下游引物為 Roseal-R :5’ -CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3> ;以金魚草 cDNA 為模板，經聚合酶鏈式反應分別擴增金魚草Delila基因和Roseal基因，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收擴增產物與pMD19-TSimple載體用T4DNA連接酶連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5a，連接產物與大腸桿菌DH5a的體積比為I : 10，連接產物轉入100 μ L大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，隨機挑選所得陽性克隆，經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到所述基因的編碼序列，序列如下金魚草Roseal基因atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa663金魚草DeliIa基因
權利要求
1.一種轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于該方法包括下述步驟 Cl)金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因的克隆 提取金魚草總RNA并反轉錄成cDNA備用，采用Primer Premier 5. O軟件,設計金魚草Delila和Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在金魚草Delila基因的上游引物前引入BamH I限制件酶切位點和保護堿基GAGGATCC,在下游引物前弓I入Sac I限制性酶切位點和保護堿某CAGGAGCTC,金隹草Delila基因上游引物序列為Delila-F :5，-GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG-3，，下游引物序列為 De I i Ia_R : 5 ’ -CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG-3’;在金魚草Roseal基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位點和保護堿基GA AGATCT’在下游引物前引入BstEII限制性酶切位點和保護堿基CAGGGTAACC,金魚草 Roseal 基因的上游引物為 Roseal-F :5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3>,下游引物為 Roseal-R 5，-CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3，以金隹草 cDNA 為模板，經聚合酶鏈式反應分別擴增金魚草Delila基因和Roseal基因，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收擴增產物與PMD19-T Simple載體用T4DNA連接酶連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5a，連接產物與大腸桿菌DH5a的體積比為I : 10，連接產物轉入100 μ L大腸桿菌DH5a感受態細胞中，隨機挑選所得陽性克隆，經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到所述基因的編碼序列，序列如下 金魚草Roseal基因atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa663 金魚草Delila基因atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa 50gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct 100ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc 150tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa 200tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg 250agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct 300
2.根據權利要求I所述的轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在構建含有金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因的植物表達載體的步驟(2)中，所述的用EcoR I和HindII雙酶切為:取植物表達載體pBI121、10XM Buffer、限制性內切酶EcoR I、限制性內切酶HindII、二次蒸餾水于37°C反應小時10分鐘，限制性內切酶EcoRI與限制性內切酶HindII、10XM Buffe、二次蒸餾水、植物表達載體pBI121的體積比為 3 :3 :5 19 20 ； 取植物表達載體pCAMBIA-1302、10 XMBufer、限制性內切酶EcoRI、限制性內切酶Hindll、二次蒸餾水于37°C反應2小時10分鐘，限制性內切酶EcoR I與限制性內切酶HindII、10XMBuffer、二次蒸餾水、植物表達載體pCAMBIA-1302的體積比為3 3 5 19 20。
3.根據權利要求I所述的轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在構建含有金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因的植物表達載體的步驟(2)中，所述的用BamHI和Sac I雙酶切為取含有金魚草Delila基因的pMD19_T Simple載體、IOXK Buffer、限制性內切酶BamH I、限制性內切酶SacI、二次蒸餾水于37°C反應2小時20分鐘，限制性內切酶BamH I與限制性內切酶Sac IUOXK Buffer、二次蒸餾水、含有金魚草Delila基因的pMD19-T Simple載體的體積比為3 3 5 19 20 ； 取PCAMBIA1302+中間載體、IOXK Buffer、限制性內切酶BamH I、限制性內切酶Sac I、二次蒸餾水于37°C反應小時20分鐘，限制性內切酶BamH I與限制性內切酶Sac IUOXKBuffer、二次蒸餾水、pCAMBIA1302+中間載體的體積比為3 3 5 19 :20。
4.根據權利要求I所述的轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于在構建含有金魚草Roseal基因和金魚草Delila基因的植物表達載體的步驟(2)中，所述的用BglII和BstEII雙酶切為取含有金魚草Roseal基因的pMD19-TSimple載體、.10XHBuffer、限制性內切酶Bglll、二次蒸餾水于37V反應I小時20分鐘后，再加入限制性內切酶BstEII在60°C反應I小時，限制性內切酶BglII與限制性內切酶BstEIIUOXHBuffer、二次蒸懼水、含有金魚草Roseal基因的pMD19_T Simple載體的體積比為3 :3 :5 :.19 20 ； 取pCAMBIA1302+-DEL重組質粒、10XH Buffer、限制性內切酶BglII、二次蒸餾水于.37°C反應I小時20分鐘后，再加入限制性內切酶BstEII在60°C下反應I小時，限制性內切酶BglII與限制性內切酶BstEIIUOXH Buffer、二次蒸餾水、pCAMBIA1302+_DEL重組質粒的體積比為3 3 5 19 20o
全文摘要
一種轉基因同時提高丹參中迷迭香酸和丹酚酸含量的方法，該方法包括金魚草Rosea1基因和Delila基因的克隆、構建含有金魚草Rosea1基因和Delila基因的植物表達載體、制備含有金魚草Rosea1基因和Delila基因的植物表達載體的根癌農桿菌菌株、制備轉基因丹參植株4個步驟。實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參中金魚草Rosea1基因和Delila基因的表達；對轉基因丹參中迷迭香酸和丹酚酸含量同時進行高效液相色譜測定，篩選得到迷迭香酸和丹酚酸B含量同時提高的轉基因丹參植株。采用本發明獲得的轉基因丹參植株，生長45天的干燥根中，迷迭香酸的含量為26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量達63.64±1.94mg/g，分別是同時期非轉化普通丹參中迷迭香酸和丹酚酸B的1.60倍和2.12倍。
文檔編號A01H5/00GK102876713SQ201210352630
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者王喆之, 姚偉, 宋銀, 王東浩, 陳玉芹 申請人:陜西師范大學