專利名稱：一種篩選高效降解棉秸稈木質素的糙皮側耳菌株的方法
技術領域：
本發明涉及食用菌降解利用秸桿資源和食用菌栽培技術領域，具體涉及高效降解秸桿木質素的食用菌菌株的篩選方法。
背景技術：
農作物秸桿含有大量的有機質，氮磷鉀和微量元素，是一項重要的生物資源。我國年生產秸桿近6億噸，但由于其難以被降解利用，1/3的秸桿被露天焚燒。這不僅是對資源的巨大浪費，也造成了嚴重的環境污染和一系列社會問題。秸桿難以降解的主要原因是細胞壁中木質素與半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在其中，這形成了一道天然屏障，限制了消化酶對細胞壁及細胞內容物的分解功能。棉秸桿中的木質素的含量高達25%以上，極大地限制了棉秸桿的降解利用，也是棉秸桿同其他農作物秸桿相比更難以利用的主要原因。因此消除秸桿中的木質素天然屏障，可促進秸桿資源的有效利用。其中篩選 高效的白腐菌降解木質素是重要努力方向之一。篩選高效降解秸桿木質素的白腐菌菌株的方法有多種，但普遍存在操作復雜、準確性差、成本昂貴等缺點，不宜用作大范圍菌株的篩選。因此以棉秸桿為培養料，建立一套操作簡單、成本低、準確性好的篩選方法體系，篩選高效降解棉秸桿木質素的糙皮側耳菌株，對秸桿資源的開發利用具有重要意義。既可為秸桿生物降解提供一條有效途徑，同時又可獲得經濟效益，減少環境污染。

發明內容
本發明的目的是提供一種篩選高效降解棉秸桿木質素的糙皮側耳菌株的方法，解決秸桿資源因木質素的存在而難以開發利用的問題。實現發明目的技術方案如下I、整個篩選體系分為初篩和復篩兩步，包括以下具體步驟(I)將活化培養后的不同糙皮側耳菌株接種到經過改良的PDA-Bavendamm平板培養基和經過改良的PDA-RB平板培養基上，在25 °C ± 1°C條件下培養7d進行初步篩選，每日觀察變色圈的形成情況并記錄顯色時間及顯色圈直徑；(2)將步驟(I)中篩選出的在兩種培養基上變色反應強且反應時間快的菌株接種到棉花秸桿固體培養基上，在25°C ±1°C條件下培養30d ；(3)將步驟(2)獲得的培養后的基質，采用Van Soest法測定木質素降解率并計算選擇性指數，以此為依據篩選出高效降解棉秸桿木質素的糙皮側耳菌株。所述的經過改良的PDA-Bavenda_平板培養基為在PDA培養基中加入單獨滅菌的鞣酸至終濃度為O. 01g/100ml，再按W/V為O. 1%加入過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉。所述的經過改良的PDA-RB平板培養基為在PDA培養基中加入單獨滅菌的RB亮藍至終濃度為625ug/mL，再加入過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉，棉秸桿干粉的加入量為每IOOmlPDA培養基加入O. Ig ；
所述的棉花稻桿固體培養基為5g過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉稻桿干粉，20mL合成培養液，合成培養液改為低氮無糖高無機鹽培養液，配方如下(數值為體積比)酒石酸銨液大量元素液微量元素液VBl液水=15:15:3:16。其中，酒石酸銨(22.0g/L)為氮源，大量元素液每升含 20gKH2P04、13.8gMgS04 · 7H20、1.0gCaCl2和 O. 6gNaCl,微量元素液每升含 O. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20UIOmgCoCl2 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK (SO4) 2 · 12H20、6mgH3B03 和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VB1的質量分數為100mg/L。馬鈴薯提取液按如下方法制備馬鈴薯刮去粗皮，去芽眼，準確稱取200g，切成碎塊放鍋中，加水IOOOml加熱煮沸，期間不斷攪拌；待水沸后再煮20 25min，用雙層紗布過濾，所得濾液即馬鈴薯提取液。
本發明與已有技術相比，其有益效果體現在(I)本發明建立了一整套篩選體系，分為初篩和復篩兩個步驟。初步篩選操作簡單，方便快速且成本低廉，在大規模篩選高效降解棉秸桿木質素的糙皮側耳菌株時，可以節省時間，節約成本并減少相當一部分工作量復篩定量精確，精確性好，本發明將兩種篩選方法科學組合，既操作簡單，節約成本，又準確可靠，建立了一套更為科學的篩選體系。(2)本發明初篩過程中，通過向普通變色培養基中添加適量的棉秸桿粉末，使篩選更具針對性，保證了篩選結果的準確性。(3)復篩過程中，棉秸桿固體培養基中需另加入低氮無糖高無機鹽營養液，因而碳源只能是單一的來自棉秸桿中木質纖維素的降解，保證了復篩結果的精確性。


圖I是實施例復篩實驗中各菌株木質素降解率比較。圖2是復篩實驗中各菌株選擇性指數比較。以下通過具體實施方式
對本發明技術方案做進一步說明。
具體實施例方式實施例I. I實驗材料I. I. I實驗菌種實驗采用的平菇菌株共12株，其中皖平I號、P928、P3為安徽省農業科學院園藝所提供；農平I號、P17、天達300為安徽農業大學林學與園林學院提供；蘇平I號、蘇平3號、新平400是江蘇省農科院蔬菜研究所提供；北-I、早、黑平A由華中農業大學應用真菌研究所提供。1.1.2 培養基PDA 綜合培養基馬鈴薯提取液 1000ml、葡萄糖 20g、KH2P043. 0g、MgSO4 · H2Ol. 5g、
維生素BI微量、瓊脂15. OgoPDA-Bavendamm培養基在PDA培養基中加入單獨滅菌的鞣酸至終濃度為
O.01g/100ml，再加入過60目分樣篩、粒徑小于0. 25mm的棉秸桿干粉，棉秸桿干粉的加入量為每IOOmlPDA培養基加入O. lg。PDA-RB亮藍培養基在PDA培養基中加入單獨滅菌的RB亮藍(即雷瑪唑亮藍，英文名為Remazol Brilliant Blue R，化學式為 C22H16N2O11S3)至終濃度為 625ug/mL，再加入過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉，棉秸桿干粉的加入量為每IOOmlPDA培養基加入O. Ig0稻桿固體培養基稱取5g過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉稻桿干粉于250mL錐形瓶中，加入22mL合成培養液，塞好8層紗布，另用二層報紙覆蓋并用細線捆扎好。121-125 高溫蒸汽滅菌30min。合成培養液改為低氮無糖高無機鹽培養液，配方如下(數值為體積比)合成培養液酒石酸銨液大量元素液微量元素液VB1液水=1 15 15 3 16。其中，酒石酸銨(22. Og/L)為氮源，大量元素液每升含20gKH2P04、13. 8gMgS04 · 7H20、
I.0gCaC12 和 O. 6gNaCl,微量元素液每升含 O. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20、 110mgCoC12 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK(S04)2 · 12H20、6mgH3B03和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VBl 的質量分數為 100mg/L。馬鈴薯提取液按如下方法制備馬鈴薯刮去粗皮，去芽眼，準確稱取200g，切成碎塊放鍋中，加水IOOOml加熱煮沸，期間不斷攪拌；待水沸后再煮20 25min，用雙層紗布過濾，所得濾液即馬鈴薯提取液。栽培培養基實驗組采用棉秸桿70%，麥麩26%，石灰3%，蔗糖I % ;對照組為棉籽殼70%，麥麩26%，石灰3%，蔗糖1%。I. 2實驗方法I. 2. I菌種的活化培養將待試菌株母種從保藏狀態下取出，分別斜面接種于PDA培養基上活化培養。然后將活化了的菌種接種于PDA培養基平板上，250C ±0. 5°C下培養7d后備用。I. 2. 2高效降解木素菌株的初步篩選將普通PDA培養七日齡的菌株平板用打孔器打取經直徑為3. 5mmX3. 5mm的菌塊分別接種于PDA-Bavendamm培養基平板和PDA-RB培養基平板上，25 °C ±0. 5 °C條件下培養7d，每個菌株做3個重復。每日觀察變色圈的形成情況并記錄變色時間，以菌落為中心畫出兩條相互垂直的線，變色圈直徑的測量取沿兩條線的菌落直徑增加的平均值，菌絲密度采用直觀比較判斷并記錄。選擇變色快、變色圈大的菌種待下步實驗。I. 2. 3木質素降解實驗(復篩)將初步篩選出的平菇菌株七日齡PDA平板培養基用打孔器取5. OmmX 5. Omm菌塊接種到秸桿附體培養基上，25°C ±0.5°C條件下培養30d。每個菌種設三個重復。I. 2. 4降解率的測定及選擇性指數(SF)的計算(采用意大利VELP公司的FIWE6型纖維分析儀)采用Van Soest法測木質素、纖維素和半纖維素含量。降解率=木質素(或纖維素、半纖維素)降解總量/原樣品中木質素(或纖維素、半纖維素)總量X 100%選擇性指數(SF)=木質素降解率/綜纖維素(纖維素+半纖維素)降解率X 100%。I. 2. 5栽培試驗
采用瓶栽法，每個菌株按配方，對照組和實驗組各裝10瓶，封口后，于121°C高壓濕熱滅菌120min，冷卻后以5%的接種量(以濕重計)接入各菌株栽培種，置于25°C恒溫培養箱中培養至菌絲滿袋后，移入燕房中按常規方法進行培養，米摘2潮子實體后培養結束。I. 2. 5. I子實體產量測定子實體產量采用單瓶產量計算，即依次稱量10個重復的單瓶子實體鮮重，記錄并計算平均值；I. 2. 5. 2栽培基質中木質纖維素降解率測定測定方法同I. 2. 4降解率的測定2結果與分析 2. I高效降解木素菌株的初步篩選表I各菌株PDA-Bavendamm平板顯色結果
權利要求
1.一種篩選高效降解棉秸桿木質素的糙皮側菌株的方法，其特征在于，具體包括如下步驟 (1)將待篩選菌株母種分別斜面接種于PDA培養基上活化培養，然后將活化了的菌種接種于PDA培養基平板上，25°C ±0. 5°C下培養7d后備用；所述PDA培養基按如下組分配比馬鈴薯提取液1000ml、葡萄糖20g、ΚΗ2Ρ043· 0g、MgSO4 · H2Ol. 5g、維生素B1O. lg、瓊脂15. Og ； (2)將步驟I)培養的七日齡的菌株平板用打孔器打取經直徑為3.5mmX3. 5mm的菌塊分別接種于PDA-Bavendamm培養基平板和PDA-RB培養基平板上，25 °C ±0. 5 °C條件下培養7d，每日觀察變色圈的形成情況并記錄變色時間及變色圈直徑； 所述PDA-Bavenda_培養基是向步驟I)的PDA培養基中加入單獨滅菌的鞋酸至終濃度為O. 01g/100ml，再加入過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉，所述棉秸桿干粉的加入量為每IOOmlPDA培養基加入O. Ig ； 所述PDA-RB培養基是向步驟I)的PDA培養基中加入單獨滅菌的RB亮藍至終濃度為625ug/mL，再加入過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉，所述棉秸桿干粉的加入量為每IOOmlPDA培養基加入O. Ig ； (3)將步驟(2)中篩選出的在兩種培養基上變色反應強且反應時間快的菌株接種到棉秸桿固體培養基上，在25 °C ±1°C條件下培養30d ； 所述棉稻桿固體培養基按如下組分配比5g過60目分樣篩、粒徑小于O. 25mm的棉秸桿干粉，20mL合成培養液，所述合成培養液的按體積比其配方為酒石酸銨液大量元素液微量元素液VB1液水=15:15:3:16 ;其中，酒石酸銨溶液濃度為22. Og/L，大量元素液每升含20gKH2P04、13. 8gMgS04 · 7Η20、1· OgCaCl2和O. 6gNaCl,微量元素液每升含0. 35gMnS04 · H20、60mgFeS04 · 7H20U IOmgCoCl2 · 6H20、60mgZnS04 · 7H20、95mgCuS04 · 5H20、6mgAlK (SO4)2 · 12H20、6mgH3B03 和 6mgNa2Mo04 · 2H20, VB1 的質量分數為 lOOmg/L ； (4)將步驟(3)獲得的培養后的基質，采用VanSoest法測定木質素降解率并計算選擇性指數，以此為依據篩選出高效降解棉秸桿木質素的糙皮側耳菌株。
2.根據權利要求I所述的一種篩選高效降解棉秸桿木質素的糙皮側菌株的方法，其特征在于，所述馬鈴薯提取液按如下方法制備馬鈴薯刮去粗皮，去芽眼，準確稱取200g，切成碎塊放鍋中，加水1000ml加熱煮沸，期間不斷攪拌；待水沸后再煮20 25min，用雙層紗布過濾，所得濾液即馬鈴薯提取液。
全文摘要
本發明公開了一種篩選高效降解棉秸稈木質素的糙皮側耳菌株的方法。不同的糙皮側耳菌株從保藏狀態下取出，經活化培養后接種到經過改良的PDA-Bavendamm平板培養基和經過改良的PDA-RB平板培養基上進行初步篩選出變色反應強且反應時間快的菌株，然后其接種到棉花秸稈固體培養基上再進行篩選。依據木質素降解率和選擇性指數的大小，復篩出高效降解棉秸稈木質素的糙皮側耳菌株。本發明建立了一套科學的篩選方法體系，初篩操作簡便，通過向普通變色培養基中添加適量的棉秸稈粉末，使篩選更具針對性，保證了篩選結果的準確性；棉秸稈固體培養基碳源單一，使得降解棉秸稈木質素的糙皮側耳菌株對碳源的選擇具有唯一性，保證復篩結果的精確性。
文檔編號A01G1/04GK102870598SQ20121037113
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者蔡永萍, 王金寧, 李國慶, 聶凡, 陳靜嫻 申請人:安徽農業大學