專利名稱：一種鼠李糖脂作為細胞低溫或超低溫保存的保護劑應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物表面活性劑技術領域，尤其涉及一種鼠李糖脂作為細胞低溫和超低溫保存保護劑的應用。
背景技術：
生物表面活性劑是一種具有復雜結構和多樣化基團的表面活性物質，其主要由微生物產生。生物表面活性劑在環境保護、醫藥化工、食品以及農業等各領域相比于化學表面活性劑更受青睞，因為其具有易被降解且本身無毒等特點，使其具有較大的環境友好性及生物相容性。生物表面活性劑還因為其相對特殊的結構而使其具有一般化學表面活性劑未能體現的作用。由親水的1-2個鼠李糖與親脂的1-2個脂肪酸鏈連接構成的鼠李糖脂是目前研究最為廣泛的生物表面活性劑。其研究遍及采油、環境生物修復、化妝品、食品及醫藥等多個領域，最近還見報道因其獨特結構而具有特異性殺死癌細胞的作用。活的動物細胞在組織工程，細胞移植和基因工程領域都是極為重要的研究和治療工具，但是因為來源有限限制了其應用。活細胞保存技術可以有效促進其實際臨床應用。活細胞主要是采用液氮進行超低溫冷凍或者溫度處于0-4度的低溫保存，此技術也適合于組織、器官的保存。目前，新的保護劑諸如海藻糖等被用于細胞凍存或者低溫保存，但是還都存在保存效果不佳、保存條件要求苛刻和操作較為復雜等問題。雖然鼠李糖脂具有潛在的廣泛用途，但未出現作為細胞低溫或超低溫保存的保護劑的應用報道。本發明采用環境、友好的生物表面活性劑鼠李糖脂，用于細胞的低溫或超低溫保存。

發明內容
本發明的目的在于針對海藻糖作用不顯著的缺陷，提供一種鼠李糖脂在細胞低溫或超低溫保存中的作用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種鼠李糖脂作為細胞低溫或超低溫保存的保護劑應用，將鼠李糖脂與海藻糖一起添加到細胞低溫或超低溫保護劑中，作用于活細胞，使細胞維持較高的活率和極好的功能；所述鼠李糖脂的質量百分比濃度高于90%，鼠李糖脂的用量為5-100mg/L，海藻糖的用量為0. 1-1M。本發明具有的有益效果是本發明所提出的鼠李糖脂作為超低溫或低溫保護劑，可顯著提高細胞的存活率和功能。
具體實施例方式鼠李糖脂的使用方法見如下步驟1.所用的鼠李糖脂具有高于90%以上的純度(質量百分比濃度)。

2.細胞的低溫保存細胞先在37°C預培養12-18小時后，被轉移至0-4°C進行低溫培養24-36小時，其中低溫培養過程中培養基添加了 0.1-1M海藻糖和5-100mg/L的鼠李糖脂。低溫保存結束后，將細胞復溫至37°C，并進行培養，觀察細胞活率及功能。3.細胞的凍存由凍存培養液再添加0.1-1M海藻糖和5-100mg/L鼠李糖脂組成細胞凍存液，將待凍存的細胞加入到上述的細胞凍存液中，然后迅速轉移到程序降溫盒中，最后將冷凍管轉移至液氮中保存。細胞復溫后進行活率測定并通過培養測定細胞功能。下面結合具體實施例詳述本發明具體內容及其所帶來的顯著效果。實施例1、大鼠肝細胞凍存中使用鼠李糖脂大鼠肝細胞作為哺乳動物細胞具有體積大、易敏感的特點，因而凍存難度較大。對自行分離得到的大鼠肝細胞采用凍存的方法。為了考察鼠李糖脂和海藻糖聯用的作用，細胞凍存采用了三種保護劑配方。配方1: 1640低碳培養基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加580 u M甘草酸二銨，2mM
維生素E，0.1M海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。配方2 1640低碳培養基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加580 u M甘草酸二銨，2mM
維生素E，IM海藻糖和不同濃度的鼠李糖脂。配方3 1640低碳培養基70%，DMSO 10%, FBS 20%,再添加0.1M海藻糖和不同濃度
的鼠李糖脂。細 胞凍存一段時間后水浴復溫，用臺盼藍染色的方法測定細胞活率，結果見表1.表1:鼠李糖脂對大鼠肝細胞凍存后活率的影響
權利要求
1.一種鼠李糖脂作為細胞低溫或超低溫保存的保護劑應用，其特征在于，將鼠李糖脂與海藻糖一起添加到細胞低溫或超低溫保護液中，作用于活細胞，使細胞維持較高的活率和極好的功能；所述鼠李糖脂的質量百分比濃度高于90%，鼠李糖脂的用量為5-100 mg/L，海藻糖的用量為0. 1-1M。
全文摘要
本發明公開了一種鼠李糖脂作為細胞低溫或超低溫保存的保護劑應用，含5-100mg/L的鼠李糖脂用量可顯著提高凍存和低溫保存后的細胞活率和功能，作用效果顯著。
文檔編號A01N1/02GK103027032SQ20121037533
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者孟琴, 姜利芳 申請人:浙江大學