專(zhuān)利名稱(chēng)：一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法。
背景技術(shù)：
互葉白千層(Melaleuca leu cadendron)是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬的一種長(zhǎng)綠小喬木，從其新鮮枝葉和樹(shù)干提取的茶樹(shù)油，是一種強(qiáng)效的抗菌劑及免疫激活劑，是公認(rèn)優(yōu)良的天然保健醫(yī)藥材料，廣泛應(yīng)用于制藥、日化、食品、香料等行業(yè)。互葉白千層具有速生、樹(shù)干直、萌發(fā)力強(qiáng)等特點(diǎn)，定植后又可以多次收獲，具有極高的的經(jīng)濟(jì)效益，目前已在廣西、廣東、福建等多個(gè)省(區(qū))推廣種植。目前，互葉白千層主要通過(guò)種播和扦插進(jìn)行種苗繁殖，繁殖系數(shù)較低，因此建立高繁殖系數(shù)的互葉白千層組培技術(shù)對(duì)解決缺乏優(yōu)質(zhì)互葉白千層種苗的現(xiàn)狀具有重要的實(shí)踐意義。褐化現(xiàn)象與菌類(lèi)污染和玻璃化并稱(chēng)植物組織培養(yǎng)的三大難題，是指植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)物在誘導(dǎo)脫分化或再分化時(shí)，自身組織由其表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)基逐漸變褐色，最終致培養(yǎng)物死亡的現(xiàn)象。研究證明，褐化不是基因型病變，而是培養(yǎng)物被切割后，切口附近的細(xì)胞受到傷害，其分隔效應(yīng)被打破，酚類(lèi)化合物向外分泌，酚氧化酶釋放或合成并發(fā)生氧化反應(yīng)形成褐色醌類(lèi)物質(zhì)，毒害培養(yǎng)物并致其死亡。褐化現(xiàn)象的發(fā)生與植物的種類(lèi)及基因型、外植體的生長(zhǎng)部位及生理狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)條件、激素水平有關(guān)，改善培養(yǎng)條件可緩解褐化的程度。目前，防止褐化的主要措施是在培養(yǎng)基中添加防褐劑，如抗氧化的抗壞血酸，半胱氨酸和檸檬酸以及具吸附作用的活性炭，但這些措施只能減輕褐化的程度，并不能徹底解決褐化問(wèn)題。應(yīng)用研究表明，適宜濃度的稀土元素能促進(jìn)植物細(xì)胞對(duì)養(yǎng)份的吸收、轉(zhuǎn)化和利用，能清除植物器官生長(zhǎng)環(huán)境及體內(nèi)的活性氧，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的水平衡。此外，稀土元素具有細(xì)胞分裂素作用，能促進(jìn)植物器官快速生長(zhǎng)。目前有關(guān)稀土元素在促進(jìn)互葉白千層叢生芽及防止繼代培養(yǎng)褐化的應(yīng)用方面尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供出一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，且可減少培養(yǎng)基中的激素用量的促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法。本發(fā)明人用含有適量濃度稀土元素的培養(yǎng)基對(duì)互葉白千層不定芽進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)證明，由于稀土元素具有激素樣的作用以及促進(jìn)植物細(xì)胞對(duì)養(yǎng)份的吸收利用，從而促進(jìn)互葉白千層叢生芽的增殖，并可部分替代2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)或完全替代N6-苯甲酰基酰嘌呤出-BA)。此外，稀土元素能清除植物器官生長(zhǎng)環(huán)境及體內(nèi)的活性氧，從而抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的氧化以及酚氧化酶釋放或合成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法，包括以下的步驟(I)配制培養(yǎng)基在改良MS培養(yǎng)基中添加3-10g/L的瓊脂，0-3. Omg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸(2,4-D), 0-3. Omg/L N6-苯甲酰基酰嘌呤(6_BA),0. l_30mg/L的單一或混合稀土化合物，調(diào)節(jié)PH5. 4 5. 8，并進(jìn)行高壓滅菌處理；(2)叢生芽增殖培養(yǎng)將互葉白千層不定芽接入上述培養(yǎng)基中，在溫度(25±2) °C，光照為1500-30001ux的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)20-30天。步驟(I)所用的改良MS培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖代替蔗糖的MS培養(yǎng)基；步驟(I)所用的單一或混合稀土元素的化合物包括鑭、鈰、釹、鐠、釤的硝酸鹽和
氧化物；步驟(2)所述的互葉白千層不定芽為由早春即將萌動(dòng)的休眠芽器官誘導(dǎo)分化而來(lái)的叢生芽。目前國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)于稀土元素促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的專(zhuān)利和文獻(xiàn)報(bào)道，而本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、易行、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可大幅度地提高互葉白千層繁殖系數(shù)和有效地防止繼代培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的發(fā)生。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一I.配制下列四種培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基CK :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，O. 01mg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA，再加入3mg/L硝酸釹[Nd(NO3)3]；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，0. 01mg/L 2，4-D，再加入3mg/L硝酸釹[Nd(NO3)3]；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L 6-BA，0. 01mg/L2，4-D ；再加入lmg/L硝酸釹[Nd(NO3)3]。2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度26°C，光照為20001UX的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)25天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 I. 8倍，到培養(yǎng)第15天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為25%，到培養(yǎng)第25天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為33% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 6. 5倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 7. 2倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，繼代培養(yǎng)第20天時(shí)，褐化發(fā)生率在5%以下；在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 4倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。實(shí)施例二
I.配制下列四種培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基CK :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA,再加入5mg/L硝酸鑭[La(NO3)3]；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，O. O lmg/L 2，4-D，再加入5mg/L硝酸鑭[La(NO3)3]；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入2mg/L硝酸鑭[La (NO3) 3]。2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度25°C，光照為25001ux的 條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)27天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 2. I倍，到培養(yǎng)第15天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為27%，到培養(yǎng)第25天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為34% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 5. 9倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 6. 2倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 5倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。實(shí)施例三I.配制下列四種培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基CK :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA,再加入lmg/L氧化鐠(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，0.01mg/L 2，4_D，再加入lmg/L氧化鐠(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 5mg/L氧化鐠(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液。2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度25°C，光照為30001ux的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)20天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 2. 9倍，到培養(yǎng)第55天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為11%，到培養(yǎng)第20天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為26% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 6. 5倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 4倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 7倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。
實(shí)施例四I.配制下列四種培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基CK :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA,再加入5mg/L硝酸鈰銨[(NH4)Ce(NO3)6]；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，O. O lmg/L 2，4-D，再加入5mg/L硝酸鈰銨[(NH4)Ce(NO3)6]；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入3mg/L硝酸鈰銨[(NH4) Ce (NO3) 6]。
2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度25°C，光照為15001UX的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)30天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 I. 7倍，到培養(yǎng)第15天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為25%，到培養(yǎng)第25天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為33% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 6. 5倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 5. 5倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，繼代培養(yǎng)第20天時(shí)，褐化發(fā)生率在5%以下；在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 7倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。實(shí)施例五I.配制下列四種培養(yǎng)基培養(yǎng)基CK (對(duì)照組)在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，0· Olmg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA，再加入O. 5mg/L硝酸釤[Sm(NO3)3]；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，O. O lmg/L 2，4_D，再加入O. 5mg/L 硝酸釤[Sm(NO3)3]；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 2mg/L硝酸衫[Sm (NO3) 3]。2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度27°C，光照為20001ux的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)30天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 2. 9倍，到培養(yǎng)第15天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為20%，到培養(yǎng)第25天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為35% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 7. 9倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 7. 4倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 9. 2倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。實(shí)施例六I.配制下列四種培養(yǎng)基培養(yǎng)基CK (對(duì)照組)在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. 0mg/L6_BA，O. Olmg/L 2，4-D ；培養(yǎng)基A :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA，再加入O. 2mg/L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；培養(yǎng)基B :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，O. O lmg/L 2，4_D，再加入O. 2mg/ L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；培養(yǎng)基C :在改良MS培養(yǎng)基中添加7g/L的瓊脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 05mg/L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；在上述中的Re = 60. I % La (NO3) 3+20· 9 % (NH4) Ce (NO3) 3+9· O % Pr60n+6. 8 %Nd(NO3)3+3. 2% Sm(NO3)3，w/w。2.將互葉白千層不定芽接入上述四種培養(yǎng)基中，在溫度25°C，光照為15001UX的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)20天，其結(jié)果如下在對(duì)照培養(yǎng)基CK中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 I. 5倍，到培養(yǎng)第5天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為15%，到培養(yǎng)第20天時(shí)，繼代培養(yǎng)褐化率為20% ；在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 4倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化；在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 8. 8倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化； 在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，叢生芽增殖了 10倍，繼代培養(yǎng)可保持其生長(zhǎng)質(zhì)量，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程基本上不發(fā)生褐化。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)配制培養(yǎng)基在改良MS培養(yǎng)基中添加3-10g/L的瓊脂，0-3.Omg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0-3. Omg/L N6-苯甲酰基酰嘌呤(6_BA)，0. l_30mg/L的單一或混合稀土化合物，調(diào)節(jié)PH5. 4 5. 8，并進(jìn)行高壓滅菌處理； (2)叢生芽增殖培養(yǎng)將互葉白千層不定芽接入上述培養(yǎng)基中，在溫度(25±2)°C，光照為1500-30001ux的條件下，每天光照12小時(shí)，培養(yǎng)20-30天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法，其特征在于所述的改良MS培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖代替蔗糖的MS培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法，其特征在于所述的單一或混合稀土化合物包括鑭、鈰、釹、鐠、釤的硝酸鹽和氧化物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法，其特征在于所述的互葉白千層不定芽為由早春即將萌動(dòng)的休眠芽器官誘導(dǎo)分化而來(lái)的叢生芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養(yǎng)褐化的方法。該方法將互葉白千層不定芽接種在含有稀土元素、分裂素和生長(zhǎng)素的改良MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，可有效地促進(jìn)叢生芽增殖以及防止繼代培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的發(fā)生。所述單一或混合稀土元素化合物包括鑭、鈰、釹、鐠、釤的硝酸鹽和氧化物，且所述稀土元素可減少或替代培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102870677SQ20121038220
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者莫昭展, 梁海清, 朱宇林, 黃肈宇 申請(qǐng)人:玉林師范學(xué)院