專利名稱：桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及將目的基因轉入發(fā)根農(nóng)桿菌后侵染桑樹外植體，誘導出桑樹轉基因毛狀根，建立一種桑樹轉基因毛狀根高效誘導和繁殖體系的方法。
背景技術：
桑樹(Morus L.)屬多年生木本雙子葉植物，是應用于蠶桑產(chǎn)業(yè)一種重要的經(jīng)濟作物，是家蠶的唯一飼料來源；桑樹在林業(yè)、食品行業(yè)也具有重要地位，桑葉中富含人體所需的多種氨基酸，其果實、根、莖、葉等都具有很高的藥用價值和保健價值；同時，桑樹能產(chǎn)生多種具有重要的藥用價值的次生代謝物質(zhì)，如槲皮素等黃酮類化合物及多種具有抗病毒、 抗菌、抗氧化、抗衰老、預防腫瘤等功能的活性物質(zhì)(李想韻，朱鴻，孫一銘，孫敏，桑遺傳轉化體系的建立及槲皮素合成的研究，中國中藥雜志，2010，35 (11))。我國擁有世界上最多的桑樹資源，但由于自然界生長的桑樹遺傳背景復雜，雜合性非常高，傳統(tǒng)的遺傳育種周期很長，并且很難做到對某個有價值遺傳性狀的定向育種。隨著現(xiàn)代分子技術的發(fā)展，借助轉基因育種，可以有選擇地對桑樹轉入人為需要的某個基因，實現(xiàn)定向分子育種。但目前通過桑樹愈傷細胞誘導后再分化而進行遺傳轉化存在周期長、轉化效率偏低等問題(談建中，樓程富，鐘名其，平野久，大豆球蛋白基因表達載體的構建及對桑樹的遺傳轉化，蠶業(yè)科學，1999，25 (O);而利用花粉介導轉基因往往受到季節(jié)和桑樹花性等因素制約。由于缺乏高效的桑樹轉基因技術體系支撐，國內(nèi)外利用轉基因技術進行桑樹遺傳育種的研究尚處于起步階段；對桑樹某些有價值的功能基因的鑒定和應用，以及對桑樹多種有價值的次生代謝產(chǎn)物的研究也存在諸多困難。發(fā)根農(nóng)桿菌是在植物基因工程中廣泛應用的一種侵染性很強的根瘤菌科農(nóng)桿菌屬革蘭氏陰性菌，其攜帶的Ri質(zhì)粒能有效侵染絕大多數(shù)雙子葉植物，少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物，誘發(fā)植物產(chǎn)生形狀如根系的發(fā)根即毛狀根(hairy root)。由于發(fā)根農(nóng)桿菌轉化的毛狀根具有生長速度快、分支多，能夠持續(xù)合成次生代謝產(chǎn)物，獲得的次生代謝產(chǎn)物量高且穩(wěn)定、不需要添加外源植物激素等特點，因此可作為生產(chǎn)和研究植物次生代謝物質(zhì)的生物反應器；同時，由于發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導產(chǎn)生的毛狀根易獲得再生植株等優(yōu)點，因此，建立特定植物的轉基因毛狀根體系，在定向分子育種方面具有廣泛應用前景。近年來利用發(fā)根農(nóng)桿菌已轉化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養(yǎng)體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉基因體系，極大地方便了藥用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)及遺傳育種研究。隨著現(xiàn)代分子生物學的迅速發(fā)展，向桑樹定向轉入有價值基因，建立一套有效的桑樹轉基因體系已成為可能。盡管也有誘導野生型桑樹毛狀根的報道(孔衛(wèi)青，楊金宏，盧從德，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導桑樹毛狀根體系的建立，西北植物學報，2010，30 (11))，但仍然存在誘導率偏低等問題(14-17%左右)，并且目前未見將目的基因利用植物表達載體轉入發(fā)根農(nóng)桿菌，誘導的轉基因毛狀根，建立桑樹轉基因體系的報道。AP2/ERF蛋白是植物特有的一類轉錄因子，在植物分子信號傳導途徑的級聯(lián)反應中起到了關鍵性的作用，其表達水平的變化能在很大程度上影響植物對不良環(huán)境的適應能力(Zhi-Xin Qiao et al. Molecular cloning and functional analysis of an ERFgene from cotton (Gossypium hirsutum). Biochimica et Biophysica Acta. 2008,1779 122-127)。大量研究表明，ERFs參與植物的生長發(fā)育、環(huán)境適應和對各種脅迫因子作出的抗逆性反應，與植物次生代謝產(chǎn)物的形成有密切關系(Takeshi Fukao, et al. Ethylene-Akey regulator of submergence responses in rice.Plant Science 2008,175:43-51)。而目前并無將AP2/ERF類轉錄因子或其他目的基因轉入發(fā)根農(nóng)桿菌，高效誘導桑樹轉基因毛狀根并繁殖，建立桑樹毛狀根轉基因體系的報道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術問題本發(fā)明將所選擇的目的基因轉入發(fā)根農(nóng)桿菌，快速、高效誘導出含目的基因的桑樹毛狀根，對獲得的轉基因毛狀根擴大培養(yǎng)并檢測，建立一套高效的桑樹毛狀根轉基因體系。技術方案桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，步驟包括 (I)桑樹無菌苗培養(yǎng)選取桑樹種子，或剪取野外生長的桑樹頂芽，清洗消毒后置于MS培養(yǎng)基，26°C _28°C生長，培養(yǎng)一個月后得到桑樹無菌苗，剪取無菌苗頂部葉片或莖段作為外植體；(2)外植體預培養(yǎng)將上述外植體置于事先配制的預培養(yǎng)基上培養(yǎng)36_48h ；(3)轉基因侵染菌液制備高保真酶擴增目的基因桑樹乙烯轉錄因子MaERFlJf獲得的目的片段與真核表達載體pBI121-eGFP連接后，將連接產(chǎn)物用凍融法轉化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC158341感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養(yǎng)基擴增至0D600=0. 5時，添加乙酰丁香酮(AS)，作為轉基因侵染菌液；(4)侵染與共培養(yǎng)上述預培養(yǎng)的外植體置于轉基因侵染液中浸染5-10min后，取出濾紙吸干，置于MS+50-300 μ MAS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，26°C _28°C共培養(yǎng)36_48h ；(5)外植體除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體用無菌水清洗后轉移至外植體除菌培養(yǎng)基MS+500mg/L頭孢霉素+0. I %聚乙烯吡咯烷酮(PVP，g/mL)+50-300 μ MAS，一星期后再轉移至MS+250mg/L頭孢霉素+0. I % PVP+50-300 μ M AS，直到侵染15天后出現(xiàn)桑樹毛狀根；(6)桑樹轉基因毛狀根的培養(yǎng)剪取長度約Icm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢霉素除菌培養(yǎng)基，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入添加0-1. Omg/L的吲哚乙酸的B5固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；將固體擴大培養(yǎng)的毛狀根轉入添加0-1. Omg/L的吲哚乙酸的B5液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，
繁殖結束。還包括轉基因毛狀根檢測步驟分為分子檢測和熒光檢測2個部分，取毛狀根，PCR方法檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測綠色熒光蛋白，驗證是否是桑樹轉基因毛狀根。步驟(I)所述的桑樹外植體為剪取所培養(yǎng)的高度達7-8cm桑樹無菌苗頂端2-3cm處的幼葉或莖段作為外植體。步驟(2)所述的預培養(yǎng)基為MS+2.4-DO. 1-0. 5mg/L+KT O. 5-1. 5mg/L+CaCl2l. 0-6. Og/L 的預培養(yǎng)基，pH=5. 0-5. 8。步驟(2)所述的預培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+2.4-DO. 5mg/L+KT I. 5mg/L+CaCl24. 4g/L,pH=5. 4。步驟(3)所述的轉基因侵染菌液為YEB液體培養(yǎng)基中添加的AS為50-300 μ Μ。步驟(3)所述的轉基因侵染菌液優(yōu)選為YEB液體培養(yǎng)基中添加的AS為200 μ Μ。步驟(4)所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+200 μ M AS。步驟(5)所述的外植體除菌培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+500mg/L頭孢霉素+0. I % PVP (g/mL) +200 μ M AS 及 MS+250mg/L 頭孢霉素 +0. 1% PVP (g/mL) +200 μ M AS。
步驟(6)所述的Β5固體和液體培養(yǎng)基優(yōu)選添加的吲哚乙酸均為O. lmg/L。有益效果如前所述，桑樹缺乏高效轉基因體系已經(jīng)成為桑樹功能基因、次生代謝物質(zhì)及遺傳育種研究的一個制約因素。至今未見通過毛狀根體系轉入諸如AP2/ERF類轉錄因子等外源目的基因，建立桑樹毛狀根轉基因體系的相關文獻報道。本發(fā)明不僅首次將一個與植物次生代謝及逆境脅迫相關的目的基因MaERFl轉入植物表達載體，將該載體轉入發(fā)根農(nóng)桿菌后再轉入桑樹外植體，在葉片和莖段均高效誘導出桑樹轉基因毛狀根，葉片和莖段誘導率分別達到56%和68%，而且對獲得的桑樹轉基因毛狀根擴大培養(yǎng)的方法進行了優(yōu)化，由此成功建立了桑樹毛狀根轉基因體系。該方法可省去桑樹愈傷細胞再分化的步驟，克服了利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的周期長，轉化效率偏低等問題；轉基因毛狀根誘導和繁殖不受外界環(huán)境、季節(jié)和桑樹花性等因素制約，大大提高桑樹轉基因效率；轉入的MaERFl轉錄因子基因有助于桑樹逆境脅迫下的應答機制及次生代謝物質(zhì)的研究；本發(fā)明對桑樹功能基因鑒定和研究及分子育種具有重大意義；對其他轉基因困難的木本植物提供了可靠的借鑒方法，具有廣闊的開發(fā)應用前景。


圖IA為葉片誘導出的轉MaERFl基因桑樹毛狀根；B為莖段誘導出的轉MaERFl基因桑樹毛狀根；圖2為毛狀根在B5固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；圖3為轉MaERFl基因桑樹毛狀根RolC基因檢測；圖4為轉MaERFl基因桑樹毛狀根熒光檢測。
具體實施例方式文中的“ + ”理解為“體系中含有”。實施例I :轉桑樹MaERFl轉錄因子基因毛狀根的誘導(I)桑樹外植體培養(yǎng)選取桑樹品種為沙二 X倫109桑樹種子,或剪取野外生長的沙二 X倫109桑樹頂芽，均由國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃提供。用無菌水將種子或野外剪取的桑芽清洗3-5次；用75% wt酒精消毒2min，再用無菌水清洗2次；0. 1% wt的升汞消毒5min，無菌水清洗2次；置于MS培養(yǎng)基，26°C _28°C生長，培養(yǎng)無菌苗；一個月后，當桑樹無菌苗生長至7-8cm高時，剪取無菌苗頂端2-3cm處的幼葉或莖段作為外植體，其中葉片剪成O. 5cmXO. 5cm,莖段剪成 1cm。(2)外植體預培養(yǎng)將上述外植體置于事先配置的MS+2. 4-D O. 5mg/L+KTl. 5mg/L+CaCl24. 4g/L 預培養(yǎng)基(pH=5. 4)上培養(yǎng) 36_48h。(3)轉基因侵染菌液制備將pBI121載體中的⑶S基因片段用綠色熒光蛋白eGFP基因片段代替后的改造載體；根據(jù)GenBank GQ162103. I公布的桑樹乙烯轉錄因子MaERFl 序列設計引物 MaERF-F :5’ -CTAGTCTAGAATGTGTGGAGGTGCTATTATCTC-3’ 及 MaERF-R 5’ -CGCGGATCCAAAGGCTTCGCCAGACACGGTG-3’ ；以桑樹總 RNA 為模板，以 Promega 公司反轉錄酶反轉錄，合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板，以MaERF_F/R為引物，按照Takala公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真酶說明書擴增目的基因MaERFl,擴增反應為98 °C IOs, 59 °C 5s, 72 °C 8s，30個循環(huán)；電泳驗證PCR產(chǎn)物大小，并將目的片段切膠回收；回收產(chǎn)物和pBI121-eGFP載體分別用Xba I和BamH I雙酶切；再次電泳回收目的片段，并與酶切并回收后的pBI121_eGFP載體用TaKaRa T4 DNA Ligase連接， 構建pBI121-MaERFl-eGFP質(zhì)粒；將pBI121-MaERFl_eGFP質(zhì)粒用凍融法轉化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC158341感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，轉入YEB液體培養(yǎng)基，在26_28°C，180rpm的搖床中擴增至0D600=0. 5時，添加200 μ L/L的AS (乙酰丁香酮)，作為轉基因侵染菌液。(4)侵染與共培養(yǎng)上述預培養(yǎng)的外植體置于轉基因侵染液中浸染5-10min后，取出濾紙吸干，置于MS+200yM AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，26°C -28°C共培養(yǎng)36_48h。(5)外植體除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體用無菌水清洗后轉移至外植體除菌培養(yǎng)基 MS+500mg/L 頭孢霉素 +0. I % PVP( g/mL)+AS 200 μ Μ, 一星期后再轉移至 MS+250mg/L頭孢霉素+0. I % PVP (g/mL)+AS 200μΜ的除菌培養(yǎng)基。葉片(圖1-Α)和莖段(圖1-Β)從侵染到出現(xiàn)桑樹毛狀根均約為15天。其中25個葉片中有14個產(chǎn)生毛狀根，誘導率為56% ；50個莖段外植體有34個產(chǎn)生毛狀根，誘導率為68%。轉桑樹MaERFl轉錄因子基因毛狀根擴大培養(yǎng)誘導出來的毛狀根經(jīng)過一星期的生長，剪取長度約Icm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢霉素，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養(yǎng)基(添加O. lmg/L的吲哚乙酸)擴大培養(yǎng)(圖2);將固體擴大培養(yǎng)的毛狀根轉入B5 (添加O. lmg/L的吲哚乙酸)液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，
完成繁殖。轉桑樹MaERFl轉錄因子基因毛狀根驗證分為分子檢測和熒光檢測2個部分。取一定數(shù)量毛狀根，CTAB法提取毛狀根 DNA 為模板，設計引物 rolc-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3，；rolC-R 5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，用PCR方法擴增，檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因，隨機選取的6個擴大培養(yǎng)桑樹毛狀根株系，均檢測到RolC基因的存在(圖3)，說明獲得的均為毛狀根；同時，由于MaERFl為轉錄因子，定位在細胞核上，可通過細胞核熒光驗證轉基因是否成功。取上述6個株系中長度約2-3_的毛狀根，制作成切片，用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光，結果顯示均檢測到細胞核熒光，檢出率為100%，表明所擴大培養(yǎng)的桑樹毛狀根均為轉基因毛狀根(圖4)。序列表〈110〉江蘇科技大學
〈120〉桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法〈130〉<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>33
<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Ictagtctaga atgtgtggag gtgctattat ctc33<210>2〈211 >31<212>DNA〈213〉人工序列<400>2cgcggatcca aaggcttcgc cagacacggt g31<210>3<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>3acaagccact tctgtttccc20<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>4cagcgactgc aaccagttta20
權利要求
1.桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟包括 (1)桑樹無菌苗培養(yǎng)取桑樹種子，或剪取野外生長的桑樹頂芽，清洗消毒后置于MS培養(yǎng)基，26°C_28°C生長，培養(yǎng)一個月后得到桑樹無菌苗，剪取無菌苗頂部葉片或莖段作為外植體； (2)外植體預培養(yǎng)將上述外植體置于事先配制的預培養(yǎng)基上培養(yǎng)36-48h； (3)轉基因侵染菌液制備高保真酶擴增目的基因桑樹乙烯轉錄因子MaERFl，將獲得的目的片段與真核表達載體pBI121-eGFP連接后，將連接產(chǎn)物用凍融法轉化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC158341感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養(yǎng)基擴增至0D600=0. 5時，添加乙酰丁香酮(AS)，作為轉基因侵染菌液； (4)侵染與共培養(yǎng)上述預培養(yǎng)的外植體置于轉基因侵染液中浸染5-10min后，取出濾紙吸干，置于MS+50-300 μ MAS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，26°C _28°C共培養(yǎng)36_48h ； (5)外植體除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體用無菌水清洗后轉移至外植體除菌培養(yǎng)基MS+500mg/L頭孢霉素+0. I %聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+50-300 μ M AS，一星期后再轉移至MS+250mg/L頭孢霉素+0. 1% PVP+50-300 μ MAS，直到侵染15天后出現(xiàn)桑樹毛狀根； (6)桑樹轉基因毛狀根的培養(yǎng)剪取長度Icm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢霉素除菌培養(yǎng)基，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入添加0-1. Omg/L吲哚乙酸的B5固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；將固體擴大培養(yǎng)的毛狀根轉入添加0-1. Omg/L吲哚乙酸的B5液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，繁殖結束。
2.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于還包括轉基因毛狀根檢測步驟分為分子檢測和熒光檢測兩個部分，取毛狀根，PCR方法檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測綠色熒光蛋白，驗證是否是桑樹轉基因毛狀根。
3.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(I)所述的桑樹外植體為剪取所培養(yǎng)的高度達7-8cm桑樹無菌苗頂端2-3cm處的幼葉或莖段作為外植體。
4.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(2)所述的預培養(yǎng)基為MS+2. 4-D O. 1-0. 5mg/L+KT O. 5-1. 5mg/L+CaCl2l. 0-6. Og/L 的預培養(yǎng)基,pH=5. 0-5. 8。
5.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(2)所述的預培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+2. 4-D O. 5mg/L+KT I. 5mg/L+CaCl24. 4g/L，pH=5. 4。
6.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(3)所述的轉基因侵染菌液為=YEB液體培養(yǎng)基中添加的AS為50-300 μ Μ。
7.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(3)所述的轉基因侵染菌液優(yōu)選為YEB液體培養(yǎng)基中添加的AS為200 μ M0
8.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(4)所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+200 μ M AS。
9.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(5)所述的外植體除菌培養(yǎng)基優(yōu)選為MS+500mg/L頭孢霉素+0. I % PVP+200 μ M AS及MS+250mg/L 頭孢霉素 +0. I % PVP+200 μ M AS。
10.根據(jù)權利要求I所述的桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，其特征在于步驟(6)所述的B5固體和液體培養(yǎng)基優(yōu)選添加的吲哚乙酸均為O. lmg/L。
全文摘要
桑樹轉基因毛狀根的誘導及繁殖方法，步驟包括桑樹無菌苗培養(yǎng)；外植體預培養(yǎng)；轉基因侵染菌液制備；侵染與共培養(yǎng)；外植體除菌培養(yǎng)；桑樹轉基因毛狀根的培養(yǎng)；將固體擴大培養(yǎng)的毛狀根轉入添加吲哚乙酸的B5液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，繁殖結束。該方法可省去桑樹愈傷細胞再分化的步驟，克服了利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的周期長，轉化效率偏低等問題；轉基因毛狀根誘導和繁殖不受外界環(huán)境、季節(jié)和桑樹花性等因素制約，大大提高桑樹轉基因效率；轉入的MaERF1轉錄因子基因有助于桑樹逆境脅迫下的應答機制及次生代謝物質(zhì)的研究；本發(fā)明對桑樹功能基因鑒定和研究及分子育種具有重大意義，具有廣闊的開發(fā)應用前景。
文檔編號A01H5/06GK102876709SQ201210384738
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權日2012年10月12日
發(fā)明者方榮俊, 趙衛(wèi)國, 童偉, 程嘉翎, 劉利, 張 林, 楊永華, 戚金亮 申請人:江蘇科技大學