丹參內生真菌菌絲水溶性提取物及其部位的制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種丹參內生真菌菌絲水溶性提取物（WSE），它是收集發酵培養9-14天的丹參內生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，110-130℃滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液。本發明還公開了丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)。本發明進一步公開了SWE、PPF和PSF在促進宿主丹參的組織培養物丹參毛狀根生長，提高丹參毛狀根中丹參酮類成分含量的用途。
【專利說明】丹參內生真菌菌絲水溶性提取物及其部位的制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種丹參內生真菌菌絲的水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位，此外，本發明還涉及該丹參內生真菌菌絲水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位的用途，用于促進丹參毛狀根生長和提高丹參酮類成分含量。
【背景技術】
[0002]丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)是唇形科鼠尾草屬植物,其干燥根及根莖同名入藥，始載于《神農本草經》，列為上品，是我國常用傳統中藥，味苦，性微寒，歸心、肝經，具有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩等功效。臨床廣泛用于心腦血管疾患，是國內外現代化中藥研究的熱點品種之一。現代研究表明，丹參的化學成分主要分為兩大類:一是以丹參素為基本結構的水溶性成分——酹酸類化合物，包括原兒茶醛、丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；二是脂溶性成份一二萜類化合物，包括丹參酮1、丹參酮II A、II B、隱丹參酮1、二氫丹參酮I等。臨床研究證實，丹參含有的多種化學成分具有廣泛的生物活性，其傳統藥理以擴血管，活血化瘀，改善微循環為主。現代藥理研究表明，丹參尚具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纖維化，促進組織修復和再生等多種藥理活性。丹參的市場需求大，而野生資源日益減少，栽培品種退化嚴重。人工引種栽培存在引種困難和栽培環境制約等客觀因素的影響，活性次生代謝成分的含量不穩定，藥材質量得不到保證。
[0003]利用生物技術手段獲得丹參有效化學成分相繼成為研究熱點，丹參毛狀根培養技術就是其中之一。它利用發根農桿菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主受傷部位細胞并產生大量轉化不定根， 又稱毛狀根。與傳統的細胞培養技術相比，毛狀根具有生長迅速、遺傳性狀穩定及激素自養型等特點。目前丹參毛狀根培養技術已相當成熟，但有效成分含量較低大大制約了毛狀根的應用。采用生物與非生物誘導子進行刺激，能夠有效地促進丹參毛狀根的生長和提高丹參毛狀根中次生代謝產物的含量。

【發明內容】

[0004]根據本發明的實施例，希望利用植物內生真菌資源，采用生物與非生物誘導子進行刺激，能夠有效地促進丹參毛狀根的生長和提高丹參毛狀根中次生代謝產物的含量，并提供一種丹參內生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)、丹參內生真菌菌絲多糖蛋白部位(PPF)和丹參內生真菌菌絲多糖部位(PSF)，進而提供丹參內生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)、丹參內生真菌菌絲多糖蛋白部位(PPF)、丹參內生真菌菌絲多糖部位(PSF)在丹參毛狀根中提高丹參酮類成分含量的應用，為新型誘導子的開發和探討內生真菌與宿主之間的相互關系提供依據。
[0005]本發明涉及的丹參內生真菌和中國專利CN102676392A公開的丹參內生真菌相同，它的命名為深綠木霉Trichoderma atroviride,菌株代號為D16,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏登記號為CGMCC N0.4712。[0006]1.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)的制備。
[0007]收集發酵培養9-14天的丹參內生真菌菌絲體，加入適量蒸餾水重懸，高壓鍋110-130°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為丹參內生真菌水溶性提取物。采用硫酸-苯酚法測定總糖濃度。
[0008]2.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制備。
[0009]減壓濃縮丹參內生真菌水溶性提取物WSE至適當體積，加入4-7倍體積70-95%的乙醇2-8°C靜置24-72小時，以2000-10000轉/分的轉速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，無水乙醇洗3-5次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位PPF。
[0010]3.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)的制備。
[0011]將丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位PPF重新溶于適量蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍體積的70-95%的乙醇2_8 °C靜置24-72小時，以2000-10000轉/分的轉速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，無水乙醇洗3_5次后收集沉淀。將沉淀用適量蒸餾水溶解，室溫在蒸餾水中透析24-72h (截留分子量為1000-10000Da)，然后以2000-10000轉/分的轉速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位PSF。
[0012]4.丹參毛狀根懸浮培養特征。
[0013]培養基:1/2B5培養基(NaH2PO4.H2O:75mg/L, CaCl2:56.62mg/L, KNO3:1250mg/L,(NH4)2SO4:67mg/L, MgSO4:61.05mg/L，乙二胺四乙酸二鈉:18.65mg/L，FeSO4.7H20:13.9mg/L, MnSO4.2H20:5.0mg/L, ZnSO4.7H20:1.0mg/L,硼酸:1.5mg/L, Na2MoSO4:0.125mg/L,CuSO4.5H20:0.0125mg/L, CoCl2.5H20:0.0125mg/L, K1:0.375mg/L,維生素 B1:5.0mg/L,維生素 B5:0.5mg/L，煙酸:0.5mg/L，肌醇:50mg/L，蔗糖:20000mg/L, PH (25。。):5.5)，121。。滅菌15分鐘后自然冷卻待用。
[0014]培養溫度:25±2°C。
[0015]培養時間:20-50天不等。
[0016]搖床轉速:180rpm。
[0017]培養特征:丹參毛狀根聚成團向四周生長。
[0018]5.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)對丹參毛狀根生長和丹參酮生物合成的影響。
[0019]在丹參毛狀根懸浮培養第16-24天，添加總糖濃度為30_400mg/L的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物WSE，繼續懸浮培養12-30天，毛狀根生物量提高了 30%-80%，二氫丹參酮I的含量提高了 15-40倍，丹參酮I的含量提高了 1-3倍，隱丹參酮的含量提高了 50-90倍，丹參酮II A的含量提高了 2-5倍，總丹參酮的含量(即二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A含量之和)提高了 10-25倍。丹參內生真菌菌絲水溶性提取物菌絲WSE能夠有效地提高丹參毛狀根的生物量，促進丹參酮類成分的生物合成。
[0020]6.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)對丹參毛狀根生長和丹參酮生物合成的影響。
[0021]在丹參毛狀根懸浮培養第16-24天，添加濃度為30_400mg/L丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)或丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)，繼續懸浮培養12-30天，毛狀根干重都提高了 10%-70%，二氫丹參酮I的含量都提高了 10-40倍，丹參酮I的含量都提高了 1-8倍，隱丹參酮的含量都提高了 20-50倍，丹參酮II A的含量都提高了 5-15倍，總丹參酮的含量(即二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A含量之和)都提高了 10-25倍。PPF和PSF均能夠有效地提高丹參毛狀根的生物量，促進丹參酮類成分的生物合成。
[0022]本發明首次從丹參內生真菌菌絲中制備了水溶性提取物(WSE)、多糖蛋白部位(PPF)和多糖部位(PSF)，發現WSE、PPF和PSF均能有效促進丹參毛狀根生長，同時顯著性地提高毛狀根中丹參酮類成分的含量，從而有效提高了丹參毛狀根中丹參酮類成分的產量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是丹參內生真菌在1/2B5平板培養基上的形態圖。
[0024]圖2是丹參內生真菌在1/2B5液體培養基中的形態圖。
[0025]圖3是丹參毛狀根液體懸浮培養形態圖。
[0026]圖4是丹參內生真菌菌絲水溶性提取物及其多糖蛋白部位和多糖部位作用丹參毛狀根12天的形態圖(A為對照，B為菌絲水溶性提取物處理，C為多糖蛋白部位處理，D為多糖部位處理)。
【具體實施方式】 [0027]下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的范圍。
[0028]實施例1:內生深綠木霉菌D16的發酵
[0029]將丹參內生真菌D16接種至1/2B5固體培養基上室溫培養3_5天(見圖1);然后采用打孔器打孔的方式將固體培養基上的D16菌絲接種至250ml三角瓶(內含100ml 1/2B5培養液)中，26°C、180rpm培養3_5天即得培養種子液(見圖2);最后將培養種子液接種至5L三角瓶(內含4L 1/2B5培養液)中，26°C、160rpm培養10天。
[0030]實施例2:丹參內生真菌菌絲水溶性提取物(WSE)的制備
[0031]通過減壓抽濾收集培養10天的D16菌絲體，并用蒸餾水洗滌3次；然后加入適量蒸餾水將D16菌絲體重懸，121°C高溫高壓處理40分鐘。待自然冷卻，減壓抽濾所得濾液適當濃縮即為內生深綠木霉菌D16菌絲WSE。
[0032]采用硫酸-苯酚法測定內生深綠木霉菌D16菌絲WSE中總糖濃度。以葡萄糖繪制標準曲線，獲得線性回歸方程:y=0.0136Χ - 0.0151，相關系數R2=0.9989，葡萄糖濃度范圍10_50ug/ml。[0033]實施例3:丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位(PPF)的制備
[0034]減壓濃縮內生深綠木霉菌D16菌絲WSE溶液(30L)至適當體積，加入5倍體積95%的乙醇4°C靜置48小時，以5000轉/分的轉速離心分離10分鐘得白色沉淀，無水乙醇洗3次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為內生深綠木霉菌D16菌絲PPF。
[0035]實施例4:丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位(PSF)的制備[0036]將內生深綠木霉菌D16菌絲PPF重新溶于適量蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入5倍體積的95%的乙醇4°C靜置48小時，以5000轉/分的轉速離心分離10分鐘得白色沉淀，無水乙醇洗3次后收集沉淀。將沉淀用適量蒸餾水溶解，室溫在蒸餾水中透析48小時(截留分子量為2000Da)，然后通過5000轉/分的轉速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為內生深綠木霉菌D16菌絲PSF。
[0037]實施例5:丹參毛狀根懸浮培養特征
[0038]本發明采用的是搖床培養，250ml體積的三角瓶中盛1/2B5培養液100ml，將預先液體培養好的丹參毛狀根接種至已滅菌的培養基中，每瓶接種lg，在25°C、180rpm下暗培養20天-50天不等，每周更換一次培養液(見圖3)。丹參毛狀根收獲時，倒掉培養液，蒸餾水洗3次后濾紙吸干殘留水分。50°C烘干至恒重后，按實施例6中描述方法測定丹參酮類成分的含量。
[0039]實施例6:丹參毛狀根中丹參酮類成分含量的測定
[0040]采用高效液相色譜法(HPLC)分析丹參毛狀根中丹參酮類成分的含量，主要定量檢測二氫丹參酮1、丹參酮1、隱丹參酮和丹參酮II A的含量。具體步驟如下:
[0041]丹參毛狀根HPLC進樣樣品的制備:精密稱量烘干至恒重的毛狀根，記錄干重后研成粉末。精密稱取毛狀根粉末0.15g，加入5ml甲醇超聲提取3次，每次40分鐘。所得提取溶液過0.45um微孔濾膜即得HPLC進樣樣品溶液。
[0042]HPLC色譜分析條件:色譜柱:Z0RBAX-C18反相柱(4.6X 250mmX 5 μ m);流動相:Η20(+0.5%HC00H)-HCN，梯度洗脫:[time(min): D(HCN)] = [0.0: 20% ]-[20.0: 40%]-[21.0: 80%]-[40.0: 90%]-[45.0: 20%];柱溫:30°C;流速:0.8ml/min ;檢測波長280nm。
[0043]標準曲線的確定 :(1)準確稱取二氫丹參酮I 2mg溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為2.5、5、10、20、40ng/ml的二氫丹參酮I標準品HPLC進樣溶液。(2)準確稱取丹參酮I Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為2、4、6、8、10ng/ml的丹參酮I標準品HPLC進樣溶液。(3)準確稱取隱丹參酮Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為1、5、25、50、100ng/ml的隱丹參酮標準品HPLC進樣溶液。(4)準確稱取丹參酮II A Img溶于IOml甲醇中，精密稀釋得到濃度為0.5、1.0,2.0,4.0,8.0ng/ml的丹參酮II A標準品HPLC進樣溶液。將所有標準品溶液按上述HPLC色譜條件進樣分析。以HPLC的峰面積為Y，以進樣標準品溶液濃度(mg/ml)為X，獲得4種丹參酮線性回歸方程(見表1)。
[0044]丹參毛狀根樣品中丹參酮的含量測定:取上述制備的樣品溶液20ul進樣，按上述H PLC色譜條件進行丹參酮類成分的分析，根據回歸方程進行定量計算。
[0045]表1四種丹參酮的線性回歸方程
【權利要求】
1.一種丹參內生真菌菌絲水溶性提取物，其特征是，它是收集發酵培養9-14天的丹參內生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，110-130°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液。
2.一種丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位，其特征是，減壓濃縮權利要求1所述的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物，加入4-7倍體積量體積濃度為70-95%的乙醇，在2-8°C靜置24-72小時，以2000-10000轉/分的轉速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，用無水乙醇洗脫3-5次后收集沉淀，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內生真菌菌絲多糖水溶性提取物蛋白部位。
3.一種丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位，其特征是，將權利要求2所述的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位溶于蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，加入4-7倍體積量體積濃度為70-95%的乙醇，在2-8°C靜置24-72小時，以2000-10000轉/分的轉速離心分離10-15分鐘得白色沉淀，用無水乙醇洗脫3-5次后收集沉淀；將沉淀用蒸餾水溶解，室溫下在蒸餾水中透析24-72h，截留分子量為1000-10000Da，以2000-10000轉/分的轉速離心分離得到上清液，真空冷凍干燥所得白色粉末即為丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位。
4.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物用于促進丹參毛狀根生長和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類成分含量。
5.根據權利要求4所述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物，繼續懸浮培養12-30天。
6.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位用于促進丹參毛狀根生長和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類成分含量。
7.根據權利要求6所 述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖蛋白部位，繼續懸浮培養12-30 天。
8.丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位用于促進丹參毛狀根生長和/或提高丹參毛狀根中丹參酮類成分含量。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征是，在丹參毛狀根懸浮培養第16-24天，添加總糖濃度為30-400mg/L的丹參內生真菌菌絲水溶性提取物多糖部位，繼續懸浮培養12-30 天。
【文檔編號】A01G7/06GK103798293SQ201210441649
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月7日 優先權日:2012年11月7日
【發明者】明乾良, 秦路平, 韓婷, 張巧艷, 鄭承劍, 張宏, 賈敏 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學