專利名稱：一種豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法
技術領域：
本發明涉及一種畜牧獸醫生產領域。
背景技術：
豬精液顆粒冷凍保存過程中，由于冷凍、解凍極易引起精子損傷，導致精子活力、頂體完整率、存活時間以及情期受胎率和平均窩產仔數等指標較低，并且現有技術中冷凍豬精液的操作程序復雜，如何稀釋和冷凍精子從而更好的保護豬精液并精簡程序，是本領域技術人員亟需解決的技術問題。

發明內容
為了解決現有技術中存在的問題，降低精子的冷凍損傷，提高解凍后的精子活力和輸精后的受胎率，是本發明關注的問題。本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法包括如下步驟(I)、采精收集豬濃份精液，用紗布過濾進集精杯后，置于37°C的水浴中，并進行常規品質檢查，選擇無異味，色澤乳白色，精子形態正常，活力在O. 7以上、密度大于IXlO9個/毫升的精液；(2)、配制冷凍保護稀釋液基礎液的配方為葡萄糖8 10g、EDTA O.1 O. 2g、雙蒸水IOOml ;冷凍保護稀釋液的配方為3%甘油、O. 5%乙二醇、O.1 O. 2mg/ml的ATP、20%的卵黃；(3)、稀釋將步驟⑵得到的冷凍保護稀釋液加熱到37°C，并按1:1的比例加入到步驟(I)得到的精液中，緩緩搖勻使精液稀釋；(4)、平衡將步驟(3)得到的稀釋精液裝入三角瓶中，在三角瓶上塞橡膠塞；將其放入裝有37°C水浴的保溫水壺中，然后將水壺放入5-7°C的冰箱中，平衡3 4小時，平衡后鏡檢精子的活力；(5)、冷凍在鋼質冷凍盒中倒入液氮，使液氮面距盒邊緣約O. 5 1. 5cm處，待盒上篩網溫度降至_135°C時，開始快速滴凍；滴凍完畢后，蓋上保溫板保溫4-5分鐘，然后將顆粒直接投入液氣；(6)、解凍事先準備兩種溫度的解凍水浴，第一種溫度為55 65°C，第二種溫度為37V,先將冷凍顆粒從液氮中取出，迅速投入處于第一種溫度水浴中的鋁盒內，待其即將融化完時取出鋁盒，再放入第二種溫度的水浴中，融化后的精液以備檢測。(7)、檢測用常規的方法檢測凍后精液的幾項指標，而其存活時間是在精子解凍后，將等溫的解凍稀釋液按1:1的比例加入到精液中進行稀釋，然后放入37°c的水浴中，每間隔2 3小時檢測其活力，直至無活精子為止。本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法通過在豬的顆粒冷凍稀釋液中添加不同的冷凍保護劑和改進冷凍保存方法，在稀釋液中添加不同的冷凍保護劑的成分和改進冷凍保存方法，解凍的精子活力為O. 36±O. 04 ;頂體完整率為62. O±7.1 ;存活時間為28. 5±3. 3天；輸精后的情期受胎率為87. 2%，平均窩產仔數為8. 6個。
具體實施例方式為了使本領域技術人員更清楚的理解本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法，下面通過具體實施方式
詳細描述其技術方案。本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法包括如下步驟I)、采精收集豬濃份精液，用4層紗布過濾進集精杯后，置于37°C的水浴中，并進行常規品質檢查，選擇無異味，色澤乳白色，精子形態正常，活力在0. 7以上、密度大于I X IO9個/毫升的精液；2)、配制冷凍保護稀釋液基礎液的配方為葡萄糖8 10g、EDTA0.1 0. 2g、 雙蒸水IOOml ;冷凍保護稀釋液的配方為3%甘油、0. 5%乙二醇、0.1 0. 2mg/ml的ATP、20%的卵黃。3)、稀釋將步驟2得到的冷凍保護稀釋液加熱到37°C，并按1:1的比例加入到步驟I得到的精液中，緩緩搖勻使精液稀釋；4)、平衡將步驟3得到的稀釋精液裝入三角瓶中，在三角瓶上塞橡膠塞；將其放入裝有37°C水浴的保溫水壺中，然后將水壺放入5-7°C的冰箱中，平衡3個半小時，平衡后鏡檢精子的活力；5)、冷凍在鋼質冷凍盒(直徑29cm，高6cm)中倒入液氮，使液氮面距盒邊緣約Icm處，待盒上篩網溫度降至_135°C時，進行快速滴凍；滴凍完畢后，蓋上保溫板保溫4-5分鐘，然后將顆粒直接投入液氮；6)、解凍事先準備兩種溫度的解凍水浴(60°C和37°C )，先將冷凍顆粒從液氮中取出，迅速投入處于60°C水浴中的鋁盒內，待其即將融化完時，從60°C的水浴中取出鋁盒，再放入37 °C的水浴中，融化后的精液以備檢測。7)、檢測用常規的方法檢測凍后精液的各項指標，而其存活時間是在精子解凍后，將等溫的解凍稀釋液按1:1的比例加入到精液中進行稀釋，然后放入37°C的水浴中，每間隔2小時檢測其活力，直至無活精子為止。本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法通過在在顆粒凍精中，以甘油、乙二醇為抗凍劑，并添加不同量的ATP以及改進冷凍保存方法，降低豬精液的冷凍損傷，提高解凍后精子的活力，提聞輸精后的情期受:胎率。應當理解，上述具體實施方式
僅用于描述本發明的技術方案，而不用于限定本發明，本領域技術人員可以從本發明得到技術啟示，對其進行各種變型和組合，本發明的保護范圍以權利要求書為準。
權利要求
1.一種豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (1)、采精收集豬濃份精液，選擇無異味，色澤乳白色，精子形態正常，活力在0.7以上、密度大于I X IO9個/毫升的精液； (2)、配制冷凍保護稀釋液基礎液的配方為葡萄糖8 10g、EDTA0.1 0. 2g、雙蒸水IOOml ;冷凍保護稀釋液的配方為3%甘油、0. 5%乙二醇、0.1 0. 2mg/ml的ATP、20%的卵黃。
(3)、稀釋將步驟(2)得到的冷凍保護稀釋液加熱到37°C，并按1:1的比例加入到步驟(I)得到的精液中，緩緩搖勻使精液稀釋； (4)、平衡將步驟(3)得到的稀釋精液平衡3 4小時，平衡后鏡檢精子的活力； (5)、冷凍在冷凍盒中倒入液氮，待盒上篩網溫度降至_135°C時，進行快速滴凍；滴凍完畢后，蓋上保溫板保溫，然后將顆粒直接投入液氮； (6)、解凍事先準備兩種溫度的解凍水浴，先將冷凍顆粒從液氮中取出，迅速投入處于第一種溫度水浴中的鋁盒內，待其即將融化完時取出鋁盒，再放入第二種溫度的水浴中，融化后的精液以備檢測； (7)、檢測用常規的方法檢測凍后精液的各項指標。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)的采精為收集豬濃份精液，用4層紗布過濾進集精杯后，置于37°C的水浴中，并進行常規品質檢查，選擇無異味，色澤乳白色，精子形態正常，活力在0. 7以上、密度大于I X IO9個/毫升的精液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)的平衡為將步驟3得到的稀釋精液裝入三角瓶中，在三角瓶上塞橡膠塞；將其放入裝有37°C水浴的保溫水壺中，然后將水壺放入5-7°C的冰箱中，平衡3個半小時，平衡后鏡檢精子的活力。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)的冷凍為在鋼質冷凍盒中倒入液氮，使液氮面距盒邊緣約Icm處，待盒上篩網溫度降至-135°C時，進行快速滴凍；滴凍完畢后，蓋上保溫板保溫4-5分鐘，然后將顆粒直接投入液氮。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)的解凍為事先準備兩種溫度的解凍水浴，第一種溫度為55 65°C，第二種溫度為37°C，先將冷凍顆粒從液氮中取出，迅速投入處于第一種溫度水浴中的鋁盒內，待其即將融化完時取出鋁盒，再放入第二種溫度的水浴中，融化后的精液以備檢測。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7的)檢測為用常規的方法檢測凍后精液的各項指標，而其存活時間是在精子解凍后，將等溫的解凍稀釋液按1:1的比例加入到精液中進行稀釋，然后放入37°C的水浴中，每間隔2小時檢測其活力，直至無活精子為止。
全文摘要
本發明的豬精液顆粒冷凍保存稀釋和冷凍方法包括采精、配制冷凍稀釋液、稀釋、平衡、冷凍、解凍以及檢測等步驟，該方法通過在在顆粒凍精中，以甘油、乙二醇為抗凍劑，并添加不同量的ATP以及改進冷凍保存方法，降低豬精液的冷凍損傷，提高解凍后精子的活力，提高輸精后的情期受胎率。
文檔編號A01N1/02GK102986651SQ201210563279
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄧凱偉 申請人:鄧凱偉