表達昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒及其應用的制作方法【專利摘要】本發明公開了一種表達昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒及其在制備殺蟲劑中的應用。所述昆蟲促前胸腺激素為如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（c）將（a）或（b）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有昆蟲促前胸腺激素功能的蛋白質。本發明將棉鈴蟲作為模式昆蟲，通過在昆蟲體內表達前胸腺激素基因，可以促進桿狀病毒對昆蟲的殺蟲效力，從而達到控制害蟲對農作物危害的目的。本發明對于農業生產具有重大價值。【專利說明】表達昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒及其應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種表達昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒及其在制備殺蟲劑中的應用。【
背景技術：
】[0002]昆蟲的生長發育、蛻皮、變態、滯育、生殖、多型現象等生理過程以及行為反應等都離不開激素的參與。蛻皮激素(ecdysone)是由前胸腺分泌的能調節動物(主要是節肢動物門昆蟲綱、甲殼綱的動物)蛻皮的激素。蝦、蟹的幼體和成體都有蛻皮現象，無翅亞綱動物的幼蟲和成蟲具有蛻皮現象，有翅亞綱動物只有幼蟲有蛻皮現象。大多數昆蟲幼蟲有周期性蛻皮現象。[0003]蛻皮激素是以膽固醇作為骨架合成的，但昆蟲本身并不能合成膽固醇，而是直接或間接地從植物中得到。蛻皮激素由促前胸激素刺激在前胸腺合成，除前胸腺外，鱗翅目、直翅目一些昆蟲的正成熟的卵巢以及鱗翅目、直翅目發育的胚胎中，也可以合成蛻皮激素類物質或中間體。通常在昆蟲的前胸腺中先合成0-蛻皮激素(0-蛻皮酮)，再合成β-蛻皮激素(20-羥基蛻皮酮)。β-蛻皮激素的活性比α-蛻皮激素高得多，是調節昆蟲蛻皮的主要激素。[0004]昆蟲激素已成為殺蟲劑研究與開發的一個重點領域，其作用機理不同于以往作用于神經系統的傳統殺蟲劑，毒性低、污染少、對天敵和有益生物影響小，有助于可持續農業的發展、有利于無公害綠色食品生產、有益于人類健康。[0005]桿狀病毒(baculovirus)是一類具有囊膜包裹的雙鏈環狀DNA病毒,基因組大小為80-180kb。桿狀病毒的結構特征為病毒粒子呈桿狀，外面包被著一層蛋白質膜，外觀有一定規則，稱為多角體病毒(NPV)。桿狀病毒專一感染節肢動物，其自然宿主主要為鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲，還感染一些甲殼類和螨類。在自然界中，桿狀病毒存在出芽病毒粒子(buddedvirus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derivedvirus,ODV;又稱多角體包涵體，簡稱PIB或OBs)兩種病毒形式。BV是在昆蟲細胞之間傳播的一種病毒粒子，帶有病毒編碼的囊膜蛋白，可以與細胞表面的特定受體相結合，在昆蟲體內或者細胞系的細胞之間傳播。ODV是桿狀病毒在環境中的傳播形態，包埋于包涵體中。包涵體由多角體蛋白質組成，其外側為多角體囊膜，在環境中非常穩定，對病毒粒子起到保護作用。未經感染的幼蟲吞下含多角體包涵體的食物后，多角體蛋白在昆蟲中腸中的酸性PH環境下降解，釋放病毒粒子核衣殼，病毒接觸并感染昆蟲幼蟲中腸的表皮細胞組織，制造出芽病毒粒子，芽病毒粒子通過出芽經細胞質膜進入宿主昆蟲的血腔中，導致系統感染，在桿狀病毒感染后期，病毒粒子被大量多角體蛋白包被，形成多角體包涵體。桿狀病毒對宿主昆蟲有較高的致病性，對天敵安全，不污染環境，尤其是它能在害蟲種群中形成流行病而長期控制蟲口并且不產生抗藥性，明顯優于其它殺蟲劑。【
發明內容】[0006]本發明的目的是提供一種表達昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒及其在制備殺蟲劑中的應用。[0007]本發明提供了表達昆蟲促前胸腺激素基因的重組桿狀病毒。[0008]所述昆蟲促前胸腺激素為如下(a)或(b)或(c):(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將Ca)或(b)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有昆蟲促前胸腺激素功能的蛋白質。[0009]所述昆蟲促前胸腺激素基因為如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:1)序列表的序列6所示的DNA分子；2)編碼區為序列表的序列2自5’末端第30至710位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表的序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。[0010]所述重組桿狀病毒的制備方法如下:將重組桿狀病毒質粒導入昆蟲細胞并培養細胞，得到重組桿狀病毒；所述重組桿狀病毒質粒為具有所述昆蟲促前胸腺激素基因的桿狀病毒質粒。[0011]所述重組桿狀病毒質粒中，可由OP166啟動子(桿狀病毒早期啟動子)和/或PlO啟動子(桿狀病毒晚期啟動子)啟動所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達。所述opl66啟動子具體如序列表的序列5所示。所述PlO啟動子具體如序列表的序列8所示。[0012]所述重組桿狀病毒質粒可具有表達盒甲和表達盒乙；所述表達盒甲為用于表達所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達盒；所述表達盒乙為用于表達桿狀病毒多角體蛋白(Hapolh蛋白)的編碼基因的表達盒。[0013]所示重組桿狀病毒質粒具體可為將所述表達盒甲和所述表達盒乙插入Hz8egtBacmid中的attB位點得到的重組質粒N。[0014]所述重組載體具體可為將重組質粒M中Tn7L和Tn7R位點之間包括所述表達盒甲和所述表達盒乙在內的DNA片段插入Hz8ZlegtBacmid中的attB位點得到的重組質粒Q。所述重組質粒M具體可為將所述opl66啟動子、所述昆蟲促前胸腺激素基因和所述多角體蛋白的編碼基因分別插入表達載體(如載體pFastBac?DUAL)的多克隆位點得到的重組質粒。所述opl66啟動子可插入載體pFastBac?DUAL的NcoI和SmaI酶切位點之間。所述昆蟲促前胸腺激素基因可插入pFastBac?DUAL的NcoI和KpnI酶切位點之間。所述多角體蛋白的編碼基因可插入載體pFastBac?DUAL的BamHI和HindIII位點之間。[0015]所述Hz8ZlegtBacmid為將HaBacHZ8Bacmid中的脫皮甾體尿苷二磷酸葡糖轉移酶基因(又稱EcdysteroidUDP-Glucosyltransferase基因，簡稱egt基因)滅活后得到的重組質粒。所述Hz8ZlegtBacmid具體為將序列表的序列9所示的egfp基因取代HaBacHZ8Bacmid中的egt基因的開放閱讀框自5’末端116至1470位核苷酸所示的DNA片段得到的重組質粒。[0016]所述重組桿狀病毒可為出芽病毒粒子的形式或多角體包涵體的形式(多角體包涵體與出芽病毒粒子相比，具有口服感染的能力)。[0017]所述重組桿狀病毒的出芽病毒粒子具體可通過如下方法制備得到:將所述重組質粒N或所述重組質粒Q導入昆蟲細胞(如棉鈴蟲HzAml細胞)并進行培養，收集培養上清，即為含有所述出芽病毒粒子的病毒液。[0018]所述重組桿狀病毒的多角體包涵體可通過如下方法制備得到:將所述重組質粒N或所述重組質粒Q導入昆蟲細胞(如棉鈴蟲HzAml細胞)并進行培養,收集細胞沉淀,細胞沉淀中即含有所述多角體包涵體。所述重組桿狀病毒的多角體包涵體可通過將所述出芽病毒粒子接種昆蟲并收集昆蟲尸體得到。所述重組桿狀病毒的多角體包涵體具體可通過如下方法制備得到:將所述出芽病毒粒子接種昆蟲，昆蟲死亡后收集尸體并搗碎，加入水并攪勻后用紗布過濾，收集濾液并300g離心10min，收取上清液并3000g離心30min，收集沉淀，即為所述多角體包涵體。所述昆蟲可為棉鈴蟲。[0019]本發明還保護一種重組桿狀病毒的制備方法，包括如下步驟:將重組桿狀病毒質粒導入昆蟲細胞并培養細胞，得到重組桿狀病毒；所述重組桿狀病毒質粒為具有所述昆蟲促前胸腺激素基因的桿狀病毒質粒。[0020]所述重組桿狀病毒質粒中，可由opl66啟動子(桿狀病毒早期啟動子)和/或PlO啟動子(桿狀病毒晚期啟動子)啟動所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達。所述opl66啟動子具體如序列表的序列5所示。所述PlO啟動子具體如序列表的序列8所示。[0021]所述重組桿狀病毒質粒可具有表達盒甲和表達盒乙；所述表達盒甲為用于表達所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達盒；所述表達盒乙為用于表達桿狀病毒多角體蛋白(Hapolh蛋白)的編碼基因的表達盒。[0022]所示重組桿狀病毒質粒具體可為將所述表達盒甲和所述表達盒乙插入Hz8egtBacmid中的attB位點得到的重組質粒N。[0023]所述重組載體具體可為將重組質粒M中Tn7L和Tn7R位點之間包括所述表達盒甲和所述表達盒乙在內的DNA片段插入Hz8ZlegtBacmid中的attB位點得到的重組質粒Q。所述重組質粒M具體可為將所述opl66啟動子、所述昆蟲促前胸腺激素基因和所述多角體蛋白的編碼基因分別插入表達載體(如載體PFastBac?DUAL)的多克隆位點得到的重組質粒。所述opl66啟動子可插入載體pFastBac?DUAL的NcoI和SmaI酶切位點之間。所述昆蟲促前胸腺激素基因可插入pFastBac?DUAL的NcoI和KpnI酶切位點之間。所述多角體蛋白的編碼基因可插入載體pFastBac?DUAL的BamHI和HindIII位點之間。[0024]所述重組桿狀病毒可為出芽病毒粒子的形式或多角體包涵體的形式(多角體包涵體與出芽病毒粒子相比，具有口服感染的能力)。[0025]所述重組桿狀病毒的出芽病毒粒子具體可通過如下方法制備得到:將所述重組質粒N或所述重組質粒Q導入昆蟲細胞(如棉鈴蟲HzAml細胞)并進行培養，收集培養上清，即為含有所述出芽病毒粒子的病毒液。[0026]所述重組桿狀病毒的多角體包涵體可通過如下方法制備得到:將所述重組質粒N或所述重組質粒Q導入昆蟲細胞(如棉鈴蟲HzAml細胞)并進行培養,收集細胞沉淀,細胞沉淀中即含有所述多角體包涵體。所述重組桿狀病毒的多角體包涵體可通過將所述出芽病毒粒子接種昆蟲并收集昆蟲尸體得到。所述重組桿狀病毒的多角體包涵體具體可通過如下方法制備得到:將所述出芽病毒粒子接種昆蟲，昆蟲死亡后收集尸體并搗碎，加入水并攪勻后用紗布過濾，收集濾液并300g離心10min，收取上清液并3000g離心30min，收集沉淀，即為所述多角體包涵體。所述昆蟲可為棉鈴蟲。[0027]以上任一所述桿狀病毒多角體蛋白為如下(d)或(e):(d)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有多角體蛋白功能的的由序列3衍生的蛋白質。[0028]以上任一所述桿狀病毒多角體蛋白的編碼基因可為如下6)或7)或8)或9)的DNA分子:6)序列表的序列4自5’末端第157-897位核苷酸所示的DNA分子；7)序列表中序列4所示的DNA分子；8)在嚴格條件下與6)或7)限定的DNA序列雜交且編碼多角體蛋白的DNA分子；9)與6)或7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼多角體蛋白的DNA分子。[0029]本發明還保護一種殺蟲劑，其活性成分為如下物質中的至少一種:(I)含有昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；(II)昆蟲前胸腺激素基因；(III)昆蟲前胸腺激素。所述昆蟲前胸腺激素可為以上任一所述的昆蟲前胸腺激素。所述昆蟲前胸腺激素基因可為以上任一所述的昆蟲前胸腺激素基因。所述重組桿狀病毒可以為以上任一所述的重組桿狀病毒。所述殺蟲劑可為棉鈴蟲殺蟲劑。[0030]本發明還如下物質中的至少一種在制備殺蟲劑中的應用:(I)含有昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；(II)昆蟲前胸腺激素基因；(III)昆蟲前胸腺激素。所述昆蟲前胸腺激素可為以上任一所述的昆蟲前胸腺激素。所述昆蟲前胸腺激素基因可為以上任一所述的昆蟲前胸腺激素基因。所述重組桿狀病毒可以為以上任一所述的重組桿狀病毒。所述殺蟲劑可為棉鈴蟲殺蟲劑。[0031]本發明將棉鈴蟲作為模式昆蟲，通過將前胸腺激素基因在昆蟲體內過表達，可以促進桿狀病毒對昆蟲的殺蟲效力，從而達到控制害蟲對農作物危害的目的。本發明對于農業生產具有重大價值。【專利附圖】【附圖說明】[0032]圖1為重組質粒pFBD-HaPH-opl66_HaPTTH的結構示意圖。[0033]圖2為HaBacΔegt的基因組的結構示意圖。[0034]圖3為Hz8ZlegtBacmid和HaBacΔegt-HaPTTHbacmid的PCR鑒定電泳圖；1:HaBacΔegt-HaPTTHbacmid；2:Hz8ZlegtBacmid；。[0035]圖4為實施例4中培養3天后的熒光照片。[0036]圖5為實施例6中PCR擴增產物的電泳圖。[0037]圖6為實施例7中多角體包涵體的半致死時間。【具體實施方式】[0038]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。Bacmid的英文全稱為Baculovirusplasmid,中文含義為桿狀病毒質粒。Grace’s培養基粉劑:購自Invitrogen0大腸桿菌DHlOB:購自Invitrogen公司，貨號18290-015。[0039]載體pFastBac?DUAL:參考文獻:Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystemVersionD6April2004。[0040]Helper質粒:參考文獻:Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystemVersionD6April2004o[0041]HaBacHZ8Bacmid(該質粒具有改造后的桿狀病毒基因組DNA，所述改造指的是:多角體蛋白基因中插入了供轉座元件插入的attB位點，原多角體蛋白基因失活):參考文獻:Han-zhongWang,FeiDeng,PijlmanjGorbenP，Xin-wenChen,Xiu-1ianSun,VlakjJustM，Zhi—hongHu.CloningofbiologicallyactivegenomesfromaHelicoverpaarmigerasingle—nucleocapsidnucleopolyhedrovirusisolatebyusingabacterialartificialchromosome.VirusRes.2003Nov;97(2):57-63.；Yan-HongSI，Ming-GangFANG,YiHUANG,Fang-LiangZHENG,TingLI，Zh1-HongHUjHan-ZhongWANG.ConstructionandCharacterizationofaHelicoverpaarmigeraNucleopolyhedrovirusBacterialArtificialChromosomewithDeletionofEcdysteroidUDP-GlucosyltransferaseGene.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistryVol.71(2007)N0.10P2435-2441。[0042]棉鈴蟲HzAml細胞:張佑紅；王華林；朱雄偉；秦琴；陳燕；呂中；馬潔；張菁；適合棉鈴蟲細胞HzAml生長的培養基篩選及低血清馴化[J];生物工程學報；2006年04期。[0043]棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera):參考文獻:ZhaoX.,K.ffu,G.LiangandY.Gu0.2009.ModifiedfemalecallingbehaviorinCrylAc-resistantHelicoverpaarmigera(Lepidoptera:Noctuidae).PestManagementScience.65(4):353-357.。[0044]棉鈴蟲的促前胸腺激素如序列表的序列I所示(由226個氨基酸殘基組成)。棉鈴蟲的促前胸腺激素的編碼基因(HaPTTH基因)的cDNA如序列表的序列2所示，其開放閱讀框如序列表的序列2自5’末端第30至710位核苷酸組成，第430-783位核苷酸編碼活性部位氨基酸。[0045]LB培養基(pH7.0):溶劑為水，溶質及其濃度如下:酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L。[0046]實施例1、表達載體的構建[0047]1、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子(棉鈴蟲的多角體蛋白基因，又稱Hapolh基因，其開放閱讀框為序列表的序列4自5’末端第157-897位核苷酸所示；Hapolh基因編碼序列表的序列3所示的Hapolh蛋白)并將其插入載體pFastBac?DUAL的BamHI和HindIII位點之間，得到重組質粒pFBD-HaPH。[0048]2、合成序列表的序列5所不的雙鏈DNA分子(桿狀病毒早期啟動子，又稱opl66啟動子)并將其插入重組質粒pFBD-HaPH的NcoI和SmaI酶切位點之間，得到重組質粒pFBD-HaPH-opl660[0049]3、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并將其作為模板，用PHN和PHK組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0050]PHN:5，-CATGCCATGG^TGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCG|.ATGATAACTCGGCCGTTAC-3，；[0051]PHK:5’-CCGGTACCTTATTTCTCAGTAGCGTA-3’。[0052]PHN中，下劃線標注限制性內切酶NcoI的酶切識別序列，方框標注信號肽的編碼基因。PHK中，下劃線標注限制性內切酶KpnI的酶切識別序列。[0053]4、用限制性內切酶NcoI和KpnI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0054]5、用限制性內切酶NcoI和KpnI雙酶切重組質粒pFBD-HaPH_opl66，回收約6474bp的載體骨架。[0055]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pFBD-HaPH-op166-HaPTTH。根據測序結果，對重組質粒進行結構描述如下:在重組質粒pFBD-HaPH-opl66的NcoI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子(序列6中，自5’末端第I至63位核苷酸為信號肽的編碼基因，第64至744位核苷酸為HaPTTH基因；序列6編碼序列7所示的蛋白質)。[0056]實施例2、Hz8ZlegtBacmid的制備[0057]將序列表的序列9所示的egfp基因取代HaBacHZ8Bacmid中的egt基因的開放閱讀框自5’末端116至1470位核苷酸所示的DNA片段，得到Hz8^egtBacmid。[0058]實施例3、HaBacΔegt-HaPTTHbacmid的獲得[0059]機理描述:在大腸桿菌中，Helper質粒促進轉座的發生，重組質粒pFBD-HaPH-op166-HaPTTH的Tn7L和Tn7R位點之間包括HaPTTH基因和Hapolh基因(為了回補外源片段插入所造成的Hz8」egtBacmid的多角體蛋白基因失活)在內的DNA片段通過轉座作用插入Hz8ZlegtBacmid的attB位點,得到重組桿狀病毒質粒。[0060]1、將Helper質粒導入大腸桿菌DHlOB的感受態細胞，得到重組菌I。[0061]2、將Hz8ZlegtBacmid導入步驟I得到的重組菌I，得到重組菌II。[0062]3、將實施例1得到的重組質粒pFBD-HaPH-op166-HaPTTH轉化步驟2得到的重組菌II,然后涂布于LB培養基平板(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環素、100μg/mLX-gal和40μg/mLIPTG)，37°C培養24-48小時，檢查平板上的藍白斑，將白色菌落重新劃線在一個新鮮的LB培養基平板(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環素、100μg/mLX-gal和40μg/mLIPTG)，37°C培養24-48小時，取白色菌落，即為含有重組桿狀病毒質粒(又稱HaBacΔegt-HaPTTHbacmid)的菌落。[0063]Hz8ZlegtBacmid和HaBacΔegt-HaPTTHbacmid的PCR鑒定電泳圖見圖3,米用對應Hz8ZegtBacmid的引物(5，-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)和對應所述HaPTTH基因的引物(5，-ATCCTGATGAGTTGTCTGCT-3’)組成的引物對，HaBacΔegt-HaPTTHbacmid顯示1.9kb左右的目的片段，Hz8ZlegtBacmid不顯示所述目的片段。[0064]實施例4、重組桿狀病毒(出芽病毒粒子)的獲得[0065]一、重組桿狀病毒的獲得[0066]1、在35mm的小皿(裝有含10%FBS的Grace’s培養基)中接種5XIO5個棉鈴蟲HzAml細胞，27°C培養過夜，在生物安全柜中吸棄上清液，加入1mlGrace’s培養基室溫放置I小時。[0067]2、將5ygHaBacΔegt-HaPTTHbacmid和10μ1Lipofectin分別用Grace，s培養基稀釋至100μI,然后將兩者混合,每隔7min混勻一次,45min后,加入400μlGrace’s培養基，混勻。[0068]3、取完成步驟I的小皿，吸棄上清液并加入步驟2得到的混合液，27°C培養30min(每15min搖勻小皿一次);然后加入400μIGrace’s培養基，混勻，27°C培養6小時；然后加入ImL含20%FBS的Grace’s培養基，混勻，27°C培養6天后收取上清液，即為重組桿狀病毒(又稱HaBacΔegtHaPTTH)的第一代病毒液。27°C培養6天的過程中，每天在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光的生成情況，培養3天后的熒光照片見圖4(可以觀察到綠色熒光，表示侵染成功)。[0069]4、在25cm2的一次性培養瓶中按MOI=0.1的劑量用第一代病毒液感染棉鈴蟲HzAml細胞，27°C培養96小時后收集上清液，即為第二代病毒液。[0070]5、在25cm2的一次性培養瓶中按MOI=0.1的劑量用第二代病毒液感染棉鈴蟲HzAml細胞，27°C培養96小時后收集上清液，即為第三代病毒液。[0071]二、對照桿狀病毒(出芽病毒粒子)的獲得[0072]用HaBacΔegtBacmid代替HaBacΛegt-HaPTTHbacmid進行步驟一，得到桿狀病毒(又稱HaBacΔegt)的第一代病毒液、第二代病毒液和第三代病毒液。HaBacΔegt的基因組的結構示意圖見圖2。[0073]三、對照桿狀病毒(出芽病毒粒子)的獲得[0074]將重組質粒pFBD-HaPH-op166代替重組質粒pFBD-HaPH-op166-HaPTTH進行實施例3，載體pFBD-HaPH的Tn7L和Tn7R位點之間包括Hapolh基因在內的DNA片段通過轉座作用插入Hz8ZlegtBacmid的多角體蛋白基因位點(polyhedrinlocus),得到重組桿狀病毒質粒(又稱HaBacΔegt_Abacmid)。[0075]用HaBacΛegt_Abacmid代替HaBacΛegt-HaPTTHbacmid進行步驟一,得到桿狀病毒(又稱HaBacΔegt-A)的第一代病毒液、第二代病毒液和第三代病毒液。[0076]實施例5、多角體包涵體的獲得[0077]一、HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體的獲得[0078]1、棉鈴蟲養至3齡末，注射前放至冰上凍僵，用消毒的微量注射器取HaBacΔegtHaPTTH的第三代病毒液，在棉鈴蟲腹足倒數第二和第三之間注射入血淋巴中，每只棉鈴蟲注射5μ1，5天后棉鈴蟲液化死亡，收取蟲尸。[0079]2、將步驟I的蟲尸搗碎后加入蒸餾水并攪勻，用3層紗布過濾并收集濾液，將濾液300g離心10min并收取上清液，將上清液進行3000g離心30min，收集沉淀(HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體)。[0080]二、HaBacΔegt多角體包涵體的獲得[0081]用HaBacΔegt的第三代病毒液代替HaBacΔegtHaPTTH的第三代病毒液，其它同步驟一,得到HaBacΔegt多角體包涵體。[0082]三、HaBacΔegt-A多角體包涵體的獲得[0083]用HaBacΔegt-A的第三代病毒液代替HaBacΔegtHaPTTH的第三代病毒液，其它同步驟一，得到HaBacΔegt-A多角體包涵體。[0084]實施例6、多角體包涵體的半致死劑量[0085]分別將實施例5制備的HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體、HaBacΔegt多角體包涵體和HaBacΔegt-A多角體包涵體進行如下半致死劑量的檢測:[0086]1、挑選大小均一的二齡末棉鈴蟲幼蟲，置于無菌的96孔板中，28°C恒溫光照培養箱內饑餓培養16小時，讓它們脫皮進入下一齡中。[0087]2、將多角體包涵體用含有4g/100mL的蔗糖和lmg/mL食用亮藍的無菌水稀釋為1X1O6個多角體包涵體/mL、3X1O5個多角體包涵體/mL、lX1O5個多角體包涵體/mL、3XIO4個多角體包涵體/mL或IXIO4個多角體包涵體/mL的懸液(用血球計數板計數多角體包涵體)。[0088]3、將完成步驟I的棉鈴蟲幼蟲分為五組，每組48頭幼蟲，分別用步驟2得到的懸液進行飼喂，從飼喂開始計時，IOmin內中腸變為藍色的幼蟲轉入含有新鮮人工飼料的24孔板中，每天觀察2次并統計死亡率直至所有供試幼蟲死亡或者化蛹。進行三次重復實驗。用Probit回歸分析計算多角包涵體的半數致死濃劑量(LC5tl)及其標準誤，比較兩種病毒LC5tl之間的差異顯著性。[0089]HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體的半致死濃度為2.43XIO4個多角體包涵體/ml，標準差為0.39XIO4個多角體包涵體/ml，95%置信區間為1.75-3.29XIO4個多角體包涵體/ml。HaBacΔegt多角體包涵體的半致死濃度為8.12XIO4個多角體包涵體/ml,標準差為1.16X104個多角體包涵體/ml，95%置信區間為6.16-10.7XIO4個多角體包涵體/mlο兩種多角體包涵體的半致死濃度有顯著性差異(z=7.27，p〈0.05)。HaBacAegt-Af角體包涵體的半致死濃度與HaBacΔegt多角體包涵體的半致死濃度一致。[0090]4、取經步驟3處理之后48小時的棉鈴蟲，提取總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用ACTIN基因為內參基因，通過半定量PCR鑒定HaPTTH基因的表達量。[0091]用于鑒定ACTIN基因的引物如下:[0092]上游引物:5’-CCTGGTATTGCTGACCGTATGC-3’；[0093]下游引物:5’-CTGTTGGAAGGTGGAGAGGGAA-3’。[0094]用于鑒定HaPTTH基因的引物如下:[0095]上游引物:5’-TGCCGAAGGTGATGGCAATG-3’；[0096]下游引物:5，-CCTTTTCCGGGTCCTCGTTTCG-3，。[0097]PCR擴增產物的電泳圖見圖5。與飼喂HaBacΔegt多角體包涵體的棉鈴蟲相比，飼喂HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體的棉鈴蟲體內HaPTTH基因的表達量顯著增加。[0098]結果表明，過表達HaPTTH基因可以促使桿狀病毒的半致死濃度下降，大大提高桿狀病毒對棉鈴蟲的致死效率。[0099]實施例7、多角體包涵體的半致死時間[0100]分別將實施例4制備的HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體、HaBacΔegt多角體包涵體和HaBacΔegt-A多角體包涵體進行如下半致死時間的檢測:[0101]1、挑選大小均一的二齡末棉鈴蟲幼蟲，置于無菌的96孔板中，28°C恒溫光照培養箱內饑餓培養16小時，讓它們脫皮進入下一齡中。[0102]2、將多角體包涵體用含有4g/100mL的蔗糖和lmg/mL食用亮藍的無菌水稀釋為懸液。[0103]3、取完成步驟I的96頭幼蟲，用步驟2得到的懸液進行飼喂(飼喂劑量為100倍LC5tl),從飼喂開始計時，IOmin內中腸變為藍色的幼蟲轉入含有新鮮人工飼料的24孔板中，每天觀察4次(分別為7:00、13:00、18:00和23:00)并統計死亡率直至所有供試幼蟲死亡或者化蛹。進行三次重復實驗。[0104]對被感染試驗幼蟲死亡時間進行生存分析(SPSS軟件，Life-table或Kaplan-Meier方法),并計算ST5tl值,分析結果見圖6。HaBacΔegtHaPTTH多角體包涵體的半致死時間為68小時(三次試驗的平均值)。HaBacΔegt多角體包涵體的半致死時間為119小時(三次試驗的平均值)。HaBacΔegt-A多角體包涵體的半致死時間與HaBacΔegt多角體包涵體的半致死時間一致。【權利要求】1.表達昆蟲促前胸腺激素基因的重組桿狀病毒。2.如權利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于:所述昆蟲促前胸腺激素為如下(a)或(b)或(C):Ca)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有昆蟲促前胸腺激素功能的蛋白質。3.如權利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于:所述昆蟲促前胸腺激素基因為如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:O序列表的序列6所不的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第30至710位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表的序列2所不的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。4.如權利要求1至3中任一所述的重組桿狀病毒，其特征在于:所述重組桿狀病毒為權利要求5至8中任一所述方法制備得到的重組桿狀病毒。5.一種制備重組桿狀病毒的方法，包括如下步驟:將重組桿狀病毒質粒導入昆蟲細胞并培養細胞，得到重組桿狀病毒；所述重組桿狀病毒質粒為具有昆蟲促前胸腺激素基因的桿狀病毒質粒；所述昆蟲促前胸腺激素為如下(a)或(b)或(c):Ca)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)(b)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有昆蟲促前胸腺激素功能的蛋白質。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于:所述昆蟲促前胸腺激素基因為如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:O序列表的序列6所不的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第30至710位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表的序列2所不的DNA分子；4)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述重組桿狀病毒質粒中，由opl66啟動子和/或PlO啟動子啟動所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達。8.如權利要求5或6或7所述的方法，其特征在于:所述重組桿狀病毒質粒中具有表達盒甲和表達盒乙；所述表達盒甲為用于表達所述昆蟲促前胸腺激素基因的表達盒；所述表達盒乙為用于表達桿狀病毒多角體蛋白的編碼基因的表達盒。9.一種殺蟲劑，其活性成分為如下物質中的至少一種:(I)含有昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；(II)昆蟲前胸腺激素基因；(III)昆蟲前胸腺激素。10.如下物質中的至少一種在制備殺蟲劑中的應用:(I)含有昆蟲前胸腺激素基因的重組桿狀病毒、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；(II)昆蟲前胸腺激素基因；(III)昆蟲前胸腺激素。【文檔編號】A01N47/44GK103898068SQ201210575807【公開日】2014年7月2日申請日期:2012年12月26日優先權日:2012年12月26日【發明者】朱禎,王曉芳,張磊,戴艷,魏曉麗申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所