專利名稱：大白菜TuMV抗性基因retr02與等位基因Retr02、及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及大白菜TuMV抗性基因retr02與等位基因Retr02、及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
大白菜起源于中國，是我國最重要的蔬菜作物之一。大白菜病毒病是大白菜三大病害之一，對大白菜生產具有極大威脅。該病各地普遍發生，在一些產區可造成嚴重減產甚至絕產。蕪菁花葉病毒(TuMV)是侵染大白菜的主要病毒，北京地區以TUMV-C4株系為主。TuMV是ー種分布廣且寄主范圍很廣的植物病毒，主要分布在溫帯和熱帶地區。自1921年美國病毒學家Schultz首次在小白菜和蕪菁中發現TuMV以來，至今已有43科318種雙子葉植物(包括十字花科、菊科、藜科、豆科、石竹科等)及部分單子葉植物受到其侵染。TuMV對蕓薹屬植物的危害尤為嚴重，其危害性僅次于黃瓜花葉病毒(CMV)，是侵染蔬菜作物的第二大病毒。大白菜TuMV抗性遺傳復雜，不同抗性材料表現出不同水平的抗性，利用抗病品種是非常有效的防治手段。1984年鈕心恪選用不同大白菜抗性材料對FpF2和BC1群體進行抗性分析，表明大白菜對TuMV的抗性受2對相互獨立的顯性基因控制，植株只要具有其中I對基因就表現抗性。1983年Leung等報道大白菜對TuMV-Cl株系的抗性遺傳受顯性基因控制。1993年Yoon等選用對TuMV Cl C5株系均產生抗性的大白菜自交系0_2為抗病材料，研究發現TuMV的抗性遺傳受2個隱性基因控制。而Suh等用兩份TuMV抗性材料BP058和0-2與兩份感病材料ssd31和B18來研究不同株系間的相互作用，指出單株系的抗性受I個或2個顯性基因控制，當用混`合株系接種時，其抗性受2個以上主效基因和幾個微效基因控制。1995年曹光亮等采用雙列雜交設計結合配合力分析，發現白菜對TuMV的抗性為不完全顯性。I12Yong Kim采用TuMV的K1、K2株系對大白菜抗病親本(0-2)、感病親本(SE，SS)及其F1. F2, BC群體進行抗病性鑒定，結果在組合SSX0-2中，抗性由2個顯性基因控制；在組合SEX0-2中，抗性由顯性單基因控制，這表明同一抗病材料在不同的遺傳背景下對相同TuMV株系的抗性受感病親本的控制。由以上研究可知,大白菜對TuMV抗性遺傳比較復雜。目前，國內外已篩選了一系列的與TuMV抗性基因連鎖的RAPD、AFLP、SSR、SCAR標記。Hughes等利用Q)N1株系接種油菜(Brassica napus)后,用BSA法篩選具有多態性的AFLP或SSR標記，得到了 I個與抗TuMV基因連鎖的AFLP標記和6個SSR標記。_瑾琦篩選到2個與大白菜抗TuMV基因緊密連鎖的RAPD標記(0PV181400和0PV18820)，其遺傳距離分別為9. 15cM和15. 36cM。韓和平用大白菜抗病自交系Brp0058和感病自交系Brp0181雜交后代的F2分離群體為試驗材料，采用BSA法篩選到2個與TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP分子標記，利用Mapmaker作圖軟件統計分析，其遺傳距離分別為1. 15cM和8. 14cM，并將其轉化為SCAR標記。王雪以甘藍感病自交系01-16-5-7和抗病自交系20-2-5雜交后代的F2分離群體為試材，采用BSA法篩選到2個與TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP分子標記。高金萍以高抗TuMV的結球甘藍自交不親和系A21為父本，易感TuMV的結球甘藍自交不親和系1047為母本雜交后代的F2群體為試材，篩選到與抗病基因連鎖的2個RAPD標記，并將其轉化為SCAR標記。王美以高抗TuMV的大白菜普通白心株系91-12和高感TuMV的桔紅心株系T12-19雜交所得的100個小孢子培養DH株系為作圖群體。利用AFLP標記、RAPD標記和SSR標記構建大白菜分子遺傳圖譜，并在此基礎上利用JoinMap3. 0對大白菜蕪菁花葉病毒抗性基因進行了 QTLs定位。總之，當前國內外已經篩選了一系列的與TuMV抗性基因連鎖的RAPD、AFLP、SSR和SCAR標記。但是，隨著大白菜基因組測序項目的完成，開發出了大量的Indel標記,這些已有的連鎖標記與Indel標記相比,不夠穩定，比較復雜。迄今已發現的蕓薹屬抗TuMV基因主要集中在A基因組，少部分在C基因組(表
1)，而且位于C基因組的TuRB02基因具有數量性狀的抗性特點。TuRBOl是在油菜品種‘Westar’中發現的顯性基因，位于A基因組N6染色體上，該基因對生理小種I的分離具有抗性，幾乎達到免疫級別，ELISA檢測時也沒有發現病毒。基因TuRBOlb與TuRBOl —樣，位于Brassica napus的A基因組R6染色體上,但由于抗不同的生理小種,所以命名為TuRBOlb0 TuRB02為數量性狀位點抗病基因，控制著感病的程度。TuRB03為單顯性基因，對分離物CDNl的抗性為高抗。單顯性基因TuRB04和TuRB05在swede品系165中被鑒定出來，TuRB04控制對ー些TuMV株系的抗性，而TuRB05控制對這些株系的壞死應答，限制病毒在植物整個組織中的傳播。TuRB04對于TuRB05來說是上位基因，兩個基因共同控制致病型1，3株系。Walsh等在大白菜品系BP058中定位了廣譜性抗病基因，即retrOl(隱性基因)與ConTROl (顯性基因)協同控制著作物對TuMV的抗性，主要是控制病斑的擴散，其中retrOl定位于R4，ConTR01定位于R8。曹必好等以甘藍抗TuMV自交不親和系84075和感TuMV自交不親和系9797及其雜交的F2代分離群體為材料進行抗性鑒定，結果表明，84075的抗病基因對TuMV的抗性符合孟德爾遺傳規律，抗性基因為單顯性基因，并且克隆了抗TuMV相關基因(TuR2)，但未對其功能作進ー步 分析。表I蕓薹屬中TuMV抗性基因及其特征
權利要求
1.大白菜TuMV抗性基因retr02，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.權利要求1所述大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求1所述大白菜TuMV抗性基因retr02編碼的蛋白，其為 1)由SEQID No. 6或SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或 2)在SEQID No. 6或SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質。
4.權利要求2所述大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02編碼的蛋白，其為 1)由SEQID No. 8所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或 2)在SEQID No. 8所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質。
5.含權利要求1或2所述基因的載體。
6.含有權利要求5所述載體的宿主。
7.含有權利要求1或2所述基因或其特異片段的轉化植物細胞或轉基因植物。
8.權利要求1或2所述基因在分子標記輔助培育抗TuMV植物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述分子標記為表2中任ー對Indel標記 表2與retr02緊密連鎖的多態性I ndel分子標記
10.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述分子標記為表CAPS標記A602G。
全文摘要
本發明提供大白菜TuMV抗性基因retr02，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本發明提供大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明還提供大白菜TuMV抗性基因retr02編碼的蛋白及其等位基因Retr02編碼的蛋白。本發明同時提供了編碼TuMV抗性基因retr02和等位基因Retr02在分子標記輔助培育抗TuMV植物中的應用。
文檔編號A01H5/00GK103060338SQ20121057993
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者孫日飛, 錢偉, 張淑江, 王曉武, 章時蕃, 李菲, 張慧, 武劍 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所